丙型肝炎病毒探針熒光定量RT-PCR試劑盒使用說明書
丙 型 肝 炎 病 毒
探 針 法 熒 光 定 量 RT-PCR 試 劑 盒
H e p a t i t i s C V i r u s ( H C V ) P r o b e R T - q P C R K i t
使用手冊 V3.0產(chǎn)品及特點
本試劑盒可用于檢測丙型肝炎病毒。丙型病毒性肝炎，簡稱為丙型肝炎、丙肝，是
一種由丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus，HCV）感染引起的病毒性肝炎，主要經(jīng)血液傳
染，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球 HCV 的感染率約為 3%，估計約 1.8 億人感染了 HCV，
每年新發(fā)丙型肝炎病例約 3.5 萬例。丙型肝炎可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患
者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌，因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品是根據(jù)探針
法熒光定量 RT-PCR 原理開發(fā)的丙型肝炎病毒檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2. 引物等組分經(jīng)過優(yōu)化，靈敏度高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)丙型肝炎病毒 RNA 序列高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病
毒的 RNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為 5 個數(shù)
量級。
6. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
成分規(guī)格
產(chǎn)品組成
編號
規(guī)格
2 × OneStep Probe Mix
GZ021101a
550 μl
OneStep Probe Enzyme Mix
GZ021102b
110 μl
DEPC-H2O
GZ070401
1 ml
熒光模板稀釋液
GZ070407
1 ml
丙型肝炎病毒 RT-qPCR 引物-探針混合液
GZ1553000yp
160 μl
丙型肝炎病毒 RT-qPCR 陽性對照
(1×10E8 拷貝/μL)
GZ1553000pc
50 μl
保存條件
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為一年。陽性對照需要單獨放置，不要污染其他試劑。
使用方法
一、RNA 提取(樣本制備區(qū))
（由于陽性對照濃度高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，避免污染樣
品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光模板稀釋液，（最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，
得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩
1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩
1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用
用自選方法提取純化樣品 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。建
議使用病毒基因組 DNA/RNA 提取試劑盒提取 RNA。
二、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(樣本制備區(qū))
。
若無需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將陽性對照稀釋到 1×10E5 拷貝/μL 即可。
三、試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))
若有 N 個待檢樣品，準(zhǔn)備 N+2 個 qPCR 管(N 個待檢樣品+1 個陰性對照+6 個陽性對
照)，向各 qPCR 管中分別加入下列成分。
成分
樣品管
N+2 個
qPCR
陰性對照
qPCR
陽性對照
2 × OneStep Probe Mix
各 10 μL
10 μL
10 μL
OneStep Probe Enzyme Mix
各 2 μL
2 μL
2 μL
丙型肝炎病毒 RT-qPCR 引物-探針混
合液
各 3 μL
3 μL
3 μL
轉(zhuǎn)移至樣本準(zhǔn)備區(qū)。
四、添加模板(模板添加區(qū))
向 qPCR 管中分別加入 5 μl 模板，順序為陰性對照（DEPC-H2O）、待測樣品模板、丙型肝炎病毒 RT-qPCR 陽性對照，離心 30 秒，立即進行擴增反應(yīng)。
五、擴增反應(yīng)(擴增及產(chǎn)物分析區(qū))
將 qPCR 管放置在 qPCR 擴增儀器樣品槽相應(yīng)位置，進行擴增，擴增程序如下：
過程
溫度
時間
逆轉(zhuǎn)錄
50℃
20 min
預(yù)變性
95℃
10 min
qPCR 反應(yīng)
（45 個循環(huán)）
95℃
15 sec
60℃
60 sec
信號通道
FAM 通道采集熒光信號
六、結(jié)果分析
1. 如果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)
準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，推算出其濃
度。
2. 如果未制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照如下標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果：
陽性對照結(jié)果：Ct 值<30，有明顯指數(shù)增長，呈典型的 S 型曲線。
陰性對照結(jié)果：Ct 值>40 或無 Ct 值，無明顯指數(shù)增長期和平臺期。
樣本檢測結(jié)果：Ct 值<38，有明顯指數(shù)增長，表明樣本中檢測出該病毒，結(jié)果為陽性；
Ct 值>40 或無 Ct 值，表明樣本中未檢測出該病毒，結(jié)果為陰性；Ct 值在 38-40 范圍，應(yīng)
對樣本進行復(fù)檢，如重復(fù)實驗結(jié)果 Ct 值仍在 38-40 范圍，有明顯指數(shù)增長，則判定為陽
性，否則為陰性。
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