核酸疫苗的工藝開發(fā)與優(yōu)化
1989年，mRNA 疫苗概念首次提及，以BioNTech、Moderna為代表的全球核酸疫苗公司的努力下，mRNA 疫苗技術(shù)取得了突破性的進展。
mRNA 疫苗具有研發(fā)生產(chǎn)周期短、免疫原性高、高安全性、生物化學(xué)污染風(fēng)險低的優(yōu)點。目前在流感、非瘟、流行性腹瀉，口蹄疫及貓三聯(lián)等疫苗品類上有多家公司在開發(fā)。
一、核酸疫苗的基本原理
核酸疫苗是將編碼某種抗原蛋白的外源基因（DNA 或 RNA）直接導(dǎo)入動物體細胞，通過宿主細胞的表達系統(tǒng)合成抗原蛋白，誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生對該抗原蛋白的免疫應(yīng)答，進而達到預(yù)防和治療疾病的目的。根據(jù)主要成分的不同，核酸疫苗可主要分為DNA 疫苗mRNA 疫苗。
DNA 疫苗由編碼疫苗抗原的重組真核表達載體組成。mRNA 疫苗與 DNA 疫苗的工作原理相同，只是繞過了第一步（DNA載體的核易位和轉(zhuǎn)錄為mRNA）。自我復(fù)制的RNA 疫苗可能會使用較低劑量誘導(dǎo)保護性免疫，因為每個細胞表達的疫苗抗原更多。與傳統(tǒng)疫苗不同，mRNA疫苗不需要使用病原體本身或其蛋白質(zhì)，而是直接利用遺傳信息來指導(dǎo)細胞合成抗原。下面以mRNA疫苗為主介紹工藝方案。
二、mRNA的生產(chǎn)工藝
mRNA 疫苗的生產(chǎn)工藝主要包括 3 個部分：pDNA 模板的制備、mRNA 原液(Drug Substance，DS)的生產(chǎn)、遞送載體裝載及制劑灌裝。mRNA DS 的生產(chǎn)工藝包括上游的質(zhì)粒線性化、體外轉(zhuǎn)錄(In Vitro Transcription，IVT)、下游的 mRNA 純化以及原液灌裝等工藝步驟。
1. 質(zhì)粒生產(chǎn)流程
圖1. 百林科質(zhì)粒生產(chǎn)解決方案
上游通過大腸桿菌表達菌體，通過菌體收獲，下游的裂解工藝，澄清過濾、濃縮工藝，層析純化工藝可以獲得高純度的超螺旋DNA(scDNA)。
圖2. 質(zhì)粒純化解決方案
質(zhì)粒層析工藝Chromstar®6FF + MaXtar®PlasmidCap HR + MaXtar®Q HR三步法最為經(jīng)典常用，針對不同的質(zhì)粒產(chǎn)品和用戶需求，百林科也有不同的質(zhì)粒產(chǎn)品純化策略，例如可以使用BaronCHT® Type II去除HCD和ocDNA，或者使用CaCl2或硫酸銨沉淀樣品后使用MaXtar® Q+MaXtar® PlasmidCap HR/ BaronCHT® Type II兩步層析純化超螺旋質(zhì)粒。
案例分享：
圖3. 質(zhì)粒三步法峰圖
（由左至右：Chromstar® 6FF、
MaXtar® PlasmidCap HR、MaXtar® Q HR）
結(jié)論：通過經(jīng)典三步法，超螺旋純度達到90%以上，
整體收率也處于較高水平。
圖4. 兩步法峰圖
使用MaXtar® COLL 700去除RNA等雜質(zhì)、MaXtar® PlasmidCap HR填料提升超螺旋質(zhì)粒純度。收率和純度也滿足法規(guī)要求。
2. mRNA工藝流程
百林科為mRNA工藝提供一系列的解決方案，涵蓋從線性化到制劑端的關(guān)鍵設(shè)備耗材等。例如IVT過程使用CytoLinX® WB，適應(yīng)體外轉(zhuǎn)錄小體積低剪切的特點；創(chuàng)新性新產(chǎn)品RNase-free一次性使用耗材，解決產(chǎn)過程中潛在引入RNase/DNase的煩惱；實驗室及工業(yè)級的超濾的設(shè)備與耗材；此外，百林科也提供高質(zhì)量的層析純化解決方案，包括層析系統(tǒng)、層析柱以及填料相關(guān)產(chǎn)品。
圖5. mRNA生產(chǎn)工藝流程
mRNA的純化采用親和Maxgo Oligo dT+疏水MaXtar® Phenyl HR（或MaXtar® Butyl HR）進行，完成后通常需要進一步濃縮換液，通過超濾實現(xiàn)，最終得到的mRNA進行制劑灌裝，冷凍存儲，保證其穩(wěn)定性。
3. 遞送系統(tǒng)
脂質(zhì)納米顆粒（LNPs, Lipid Nanoparticles）是mRNA疫苗的關(guān)鍵載體，能有效保護mRNA并促進其在細胞中的遞送和表達。
圖6. LNP生產(chǎn)工藝流程
LNP的生產(chǎn)環(huán)節(jié)涉及大體積的流體轉(zhuǎn)運及超濾換液過程，百林科可提供完整的超濾及流體解決方案；同時針對灌裝工藝，提供高效靈活的定制，生產(chǎn)過程采用行業(yè)領(lǐng)先的微粒控制（B+A級），多樣化的選擇及健全的測試和驗證幫助實現(xiàn)LNP生產(chǎn)風(fēng)險控制。
獸用mRNA疫苗的開發(fā)和工藝解決方案涵蓋了從基礎(chǔ)研究到生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)。隨著技術(shù)的不斷進步，mRNA疫苗將在獸醫(yī)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，百林科將為動物核酸疫苗提供更加高效和安全的解決方案。
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