如何獲得高純度IgM抗體

IgM 抗體是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）的一種類型，主要存在于體液免疫應(yīng)答的早期階段�？v觀免疫球蛋白的進化史，IgM是最古老的抗體類型之一。在宿主抵御病原入侵的免疫響應(yīng)過程中，每種類型的抗體都有其獨特的功能效應(yīng)。IgM最初表達于B淋巴細胞表面，參與構(gòu)成B細胞表面受體 (BCR) 。B細胞活化后，可由漿細胞產(chǎn)生分泌型IgM (sIgM) ，參與早期體液免疫應(yīng)答。相較于其他類型的免疫球蛋白，IgM具有分子量大、抗原結(jié)合位點多、親和力高等特點，使其在抗感染免疫中發(fā)揮重要作用。然而，在實際應(yīng)用中，由于IgM與其他免疫球蛋白存在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致其純化困難。
  01 分子量大
IgM的單體大小在190 kDa左右，重鏈由一個可變區(qū) (Vμ) 和四個恒定區(qū) (Cμ1-4) 組成，輕鏈由一個可變區(qū)和一個恒定區(qū)組成 (Vκ‐Cκ/Vλ‐Cλ) ，在重鏈的C端還有一條18個氨基酸短肽對于IgM的多聚化至關(guān)重要，且將該序列整合至其他類型的抗體分子也能促使其產(chǎn)生多聚體。IgM通常以五聚體 (pentamer) 或六聚體 (hexamer) 的形式存在，兩者的分子量分別在900 kDa與1,050 kDa左右，其中五聚體是一個非正五邊形結(jié)構(gòu)，內(nèi)含一個50°左右的缺口由J鏈 (J-chain) 占據(jù)以保持構(gòu)象穩(wěn)定，是 IgG、IgA 和 IgE 的 10 倍左右。 

 
02 抗原結(jié)合位點多
每個 IgM 分子有 10 個抗原結(jié)合位點，使其具有較高的親和力和識別能力，是最有效的抗體。相比于IgG，多聚體結(jié)構(gòu)使IgM能夠多價結(jié)合抗原并且更加高效穩(wěn)定地結(jié)合補體C1q（圖2），啟動補體依賴的細胞毒效應(yīng) (CDC) 。同時，五聚體IgM中的J鏈還能夠與上皮細胞表面的多聚免疫球蛋白受體 (pIgR) 結(jié)合，進而將IgM轉(zhuǎn)運至黏膜表面參與黏膜免疫。
 
03 親和力高
由于 IgM 抗體結(jié)合抗原的位點較多，使得其與抗原的結(jié)合力相對較高。早期的IgM項目幾乎使用的都是未經(jīng)歷抗體親和力成熟天然抗體，具有較低的親和力與特異性，因此效果大多不盡人意，但這些臨床試驗至少證明了IgM的安全性。通過對IgM的工程化改造，例如在J鏈處引入CD3抗體或其他配體分子使其發(fā)揮細胞橋接作用，能夠使IgM的臨床價值進一步提升。
 
 
無論是應(yīng)用于病原感染的早期診斷還是疾病治療，如何有效獲得高純度IgM抗體是我們必須要解決的問題。相較于IgG，IgM的分子量更大、溶解度更低且更易降解，鹽濃度、pH、溫度都會在很大程度上影響IgM的穩(wěn)定性。因此在遵循CIPP純化策略的基礎(chǔ)上，對IgM的純化需要有更多考量。 百林科擁有多樣的層析填料，可滿足于不同情況的純化要求。
 
方法一、親和層析法
IgM的Fc段存在較大的空間位阻，因此通常認為Protein A難以用于IgM的親和捕獲，但這并非是絕對的。Protein A除了能夠結(jié)合抗體Fc段，還可與VH3基因參與編碼的重鏈可變區(qū)序列結(jié)合實現(xiàn)對抗體的捕獲。因此，對于IgM的純化，以百林科 MaXtar^® ARPA為代表的高載量、高耐堿Protein A抗體親和填料仍然是個值得嘗試的選擇。
 
在Protein A效果不理想的情況下，可以著眼于Fab段的其他結(jié)構(gòu)域進行親和填料的選擇。其中MaXtar^® Protein L具有廣譜的抗體結(jié)合活性，同樣可應(yīng)用于天然或重組IgM的純化。
 
考慮到IgM的穩(wěn)定性，Protein A/L低pH的洗脫條件對于部分IgM可能有些劇烈，這種情況下可以選擇其它類型的親和介質(zhì)。由于IgM具有大量的二硫鍵，基于嗜硫親和原理的百林科MaXtar^® PlasmidCap HR 親和填料也非常適用于IgM的純化。
 
除成品的親和填料外，還通過制備特定的抗原或抗體，將其固定在預(yù)活化填料上，利用IgM抗體與其他免疫球蛋白的特異性結(jié)合，實現(xiàn) IgM抗體的純化。這種方法具有較高的特異性，但操作過程較為復(fù)雜，需要制備特定的層析柱。

➤  百林科 MaXtar® ARPA 抗體親和填料是一款用于抗體純化的親和層析介質(zhì)，通過抗原與抗體之間特異性相互作用進行分離。MaXtar^® ARPA 擁有高載量、高流速、耐堿的特性：
(1) 高流速、高動態(tài)結(jié)合載量縮短了處理時間。
(2) 修飾的耐堿 rProtein A 配基可耐受 0.5M NaOH 進行 CIP。
 
 
方法二、 凝膠過濾法（含復(fù)合多模式）
鑒于IgM具有分子量大的特點，可以利用IgM與其他蛋白質(zhì)在分子大小上的差異，通過百林科Chromstar^® 6FF 凝膠過濾填料將IgM從混合物中分離出來，這種方法操作簡便，但特異性較低，容易受到大分子雜質(zhì)的干擾。且傳統(tǒng)的凝膠過濾由于上樣量小、流速低、層析過程比較耗時等原因不利于維持IgM的穩(wěn)定。因此，同樣基于尺寸排阻原理開發(fā)的百林科 MaXtar^® COLL 多模式填料系列同樣適用于將IgM從混合物中分離出來。
 
區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，百林科 MaXtar^® COLL 多模式填料由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層 ，確保 400/700KD 以上的大分子不會進孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時具有疏水和吸附負電荷作用基團的球形內(nèi)核，最大程度結(jié)合宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)。該層析介質(zhì)能很好的用于多種大分子生物祥本的分離純化。經(jīng)清潔再生后，填料可重復(fù)使用。相較于傳統(tǒng)的凝膠過濾，采用流穿模式的MaXtar^® COLL 700和MaXtar^® COLL 400都能夠支持更大的上樣體積和更高的流速，綜合效率提升了100倍，更加適合IgM的純化。

➤百林科Chromstar^® 6FF 凝膠過濾填料 是一款高度交聯(lián) (交聯(lián)比為6%) 瓊脂糖基架的凝膠過濾層析介質(zhì)，利用不同分子的分子量差異和分子構(gòu)象不同對其進行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如：重組蛋白、抗體、核酸、病毒及類病毒顆粒、多糖等類型項目。
   
➤  百林科MaXtar^® COLL 多模式填料是一款多模式層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的層析介質(zhì)，它由兩層不同的結(jié)構(gòu)組成：外殼是多孔的鈍化層 ，確保 400/700KD 以上的大分子不會進孔，直接走外水流穿；核心是偶聯(lián)了同時具有疏水和吸附負電荷作用基團的球形內(nèi)核，最大程度結(jié)合宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)。該層析介質(zhì)能很好的用于多種大分子生物樣本的分離純化。

方法三、離子交換層析法
離子交換層析法是利用IgM與其他蛋白質(zhì)在離子強度和pH值上的差異，通過離子交換樹脂將 IgM 從混合物中分離出來。這種方法操作簡便，能夠有效去除樣品中的HCP、HCD、內(nèi)毒素以及病毒。IgM的等電點分布范圍大致在5.5-7.4之間，根據(jù)不同IgM分子的實際等電點，可靈活采用流穿模式或結(jié)合洗脫模式。

➤百林科MaXtar^® Q HR 是一款高分辨率的強陰離子交換層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下電荷性質(zhì)和多少的差異對其進行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化，比如：重組蛋白、抗體、核酸、 病毒及類病毒顆粒、多糖等。
 
➤百林科MaXtar^® DEAE 是一款弱陰離子交換層析介質(zhì)，利用不同分子在特定條件下電荷性質(zhì)和多少的差異對其進行分離。該層析介質(zhì)能很好的用于多種生物分子的分離純化。相比于傳統(tǒng)的弱陰離子交換層析介質(zhì)，MaXtar^®DEAE 表現(xiàn)出更優(yōu)的性能：(1) 改良的MaXtar^® 基架具有更強剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。(2) 通過升級配基偶聯(lián)方式，提高層析介質(zhì)的動態(tài)結(jié)合載量
 
➤百林科MaXtar^® MMA HR 是一款改良瓊脂糖基架的多模式層析介質(zhì)。區(qū)別于傳統(tǒng)的離子交換層析介質(zhì)，它由多個不同性質(zhì)的基團組成：氨基、氫鍵和疏水基團。該層析介質(zhì)可以去除核酸、宿主蛋白、聚集體、病毒 等主要雜質(zhì)，廣泛應(yīng)用于多糖、抗體、病毒載體或疫苗領(lǐng)域。相比于傳統(tǒng)的單一模式層析介質(zhì)，MaXtar^® MMA HR 表現(xiàn)出更優(yōu)的性能 :
⑴ 高動態(tài)載量，一步結(jié)合大部分雜質(zhì)，節(jié)約時間和成本。
⑵ 改良的 MaXtar^® 基架具有更強剛性，因此在較低的反壓下能夠?qū)崿F(xiàn)更高工藝流速，提高工藝效率。
⑶ 細粒徑設(shè)計，分辨率高。
⑷ 耐受廣泛的 pH 和電導(dǎo)率范圍，有助于摸索最優(yōu)工藝條件。

方法四、羥基磷灰石
BARONHAP™，羥基磷灰石 [Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ ] 是一種無機純相層析介質(zhì)，高溫焙燒成球體，其晶體結(jié)構(gòu)與骨羥基磷灰石相同，且球體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，粒徑均勻。羥基磷灰石與生物分子之間具有多種模式的相互作用，可同時實現(xiàn)陽離子交換和鈣金屬親和兩種分離機制。陽離子交換主要依賴于羥基磷灰石上帶負電荷的磷酸基，同時，生物分子上的羧基簇合物、磷基簇合物等都能通過金屬親和作用與羥基磷灰石上的鈣形成更強的結(jié)合。由于這些獨特的分離機制，使得羥基磷灰石廣泛應(yīng)用于抗體、 疫苗 ( 細菌多糖、肺炎多糖、病毒等 )、核酸、酶和重組蛋白等領(lǐng)域。其中BARONHAP™ TypeⅡ在IgM上的純化應(yīng)用也普遍有著良好的純化效果。
   
陰離子Q+羥基磷灰石二型兩步法純化
   
   

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