抑制膜修復蛋白膜聯蛋白-A2可防止腫瘤侵襲和轉移

Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis

Keywords: Annexins; AsPC-1; Invasion; MDA-MB-231; Metastasis; S100 proteins; Tumor progression.

在暴露于機械應力的細胞中，質膜破壞是一種經常發(fā)生的生理事件，特別是在肌肉、上皮細胞或內皮細胞中，分別受到肌肉收縮/拉伸以及血流動力學剪切應力的影響。這些細胞具有膜修復機制，能夠在一分鐘之內重新修復損傷。膜修復障礙會導致細胞死亡，并可能導致退行性疾病的發(fā)展，如肌營養(yǎng)不良。Ca2+ 從細胞外（mM）流入細胞內（μM）環(huán)境是膜修復的主要觸發(fā)因素，膜修復主要依賴于以 Ca2+ 依賴性方式結合膜的蛋白質，如dysferlin、AHNAK、S100家族成員、ESCRT機制或膜聯蛋白。

哺乳動物的膜聯蛋白家族是胞質蛋白，它們以Ca2+ 依賴性方式與帶負電荷的磷脂（例如磷脂酰絲氨酸）結合，在不同階段參與膜修復。膜聯蛋白-A2（ANXA2）有望提供一個相關的靶點，因為它促進了各種癌癥類型的進展，包括乳腺癌、胰腺癌或膠質母細胞瘤。此外，ANXA2在許多細胞類型（包括癌細胞）的膜修復中起著至關重要的作用。

癌癥轉移是由一系列事件引起的，這些事件導致疾病通過血液或淋巴從原發(fā)腫瘤擴散到其他器官。在這些過程中，癌細胞暴露于永久性機械應力下，這些應力在幾何形狀、規(guī)模和強度上都發(fā)生了變化，這取決于它們參與的轉化。從原發(fā)腫瘤的體積壓縮開始，當轉移細胞在血流中移動時，機械限制演變?yōu)檠�流動力學和機械剪切應力，最后當它們到達非常狹窄的血管并發(fā)展到整個內皮細胞的外滲時，演變?yōu)檎掣叫岳�伸和緊密性收縮。這些機械應力很容易在癌細胞中造成質膜破壞，亟需一種有效的膜修復機制來應對這種損傷，這將為開發(fā)新的治療策略開辟道路，以阻止腫瘤侵襲和轉移。

去年，法國波爾多大學及法國國家科學研究中心和法國國家與健康醫(yī)學研究院的科研團隊開展了評估癌細胞中關鍵膜修復蛋白的抑制是否會影響體內腫瘤進展的研究。這項研究使用了具有高度侵襲性和轉移性的三陰性乳腺癌細胞系 MDA-MB-231 和胰腺癌細胞系AsPC-1，發(fā)現當將這些細胞注射到小鼠或斑馬魚中時，ANXA2的基因抑制可以阻止腫瘤侵襲和轉移過程；并證明ANXA2 的缺失可抑制癌細胞對剪切應力的反應，這導致細胞由于缺乏膜修復而死亡；而且ANXA2單克隆抗體干擾了ANXA2在癌細胞膜修復中的功能，表明它可能構成抑制腫瘤侵襲和轉移的相關工具。研究成果發(fā)表在 Cellular and Molecular Life Sciences 期刊題為“Inhibition of the membrane repair protein annexin-A2 prevents tumor invasion and metastasis”。

通過沉默ANXA2 的表達，檢測了 shANXA2 MDA-MB-231 和 shANXA2 AsPC-1 細胞在體外修復膜損傷的能力（圖1 C-F）。蛋白質印跡證實，shANXA2細胞中，ANXA2蛋白表達強烈降低（圖1 C ），且沉默 ANXA2 表達后細胞形態(tài)沒有顯著差異（圖1 D ）。此外，ANXA2 缺失對細胞增殖沒有影響，但可能會輕微干擾體外遷移。

為了確認 MDA-MB-231 和 AsPC-1 細胞的膜修復需要 ANXA2，在 Ca2+ 和FM1-43 存在下進行了膜修復測定。在對照MDA-MB-231或AsPC-1細胞中，觀察到FM1-43在激光損傷后幾秒鐘內進入細胞的膜照射部位，證實了膜破裂的存在（圖1 E）。120 秒后，大多數受損細胞表現出細胞內熒光的增加（圖1 E），強度增加約60s后達到平臺期（圖1 F），表示質膜的快速重新密封。相反，shANXA2 MDA-MB-231或shANXA2 AsPC-1細胞的熒光強度增加幅度要大得多（圖1 G-F），表示沒有質膜重封。

為了測試 ANXA2 是否被募集到損傷部位，用 ANXA2-GFP 載體轉染 shANXA2 MDA-MB-231 細胞，并通過激光消融分析膜損傷后 ANXA2 的細胞內運輸，觀察到ANXA2-GFP在幾秒鐘內被一致地募集到膜破壞位點（圖1 H、I）。這些數據表明，ANXA2 是 MDA-MB-231 和 AsPC-1 細胞膜修復所必需的。

圖1 ANXA2在MDA-MB-231細胞中高度表達，促進膜修復。

接下來，檢測了剪切應力后膜修復的差異。在沒有Ca2+ 的情況下，13.6±2.3%的細胞在暴露于剪切應力后未修復，該值遠高于沒有應用剪切應力時（0.7±0.5%）（圖2 B、E、F）。Ca2+ 存在時，該值下降到3.8±1.9%，表明約 70% 的對照細胞能夠修復膜損傷（圖2 B、E、F）。電子顯微鏡觀察剪切應力處理后MDA-MB-231細胞的形態(tài)，發(fā)現承受剪切應力的許多細胞在 Ca2+ 存在下似乎已經裂解，在沒有Ca2+ 的情況下這種現象會增加，表明這是由未修復的膜損傷引起的。這些結果表明，剪切應力會造成膜損傷，其修復需要Ca2+。

然后，檢測了沉默ANXA2表達后對剪切應力的響應。在 Ca2+ 存在時，11.3 ± 5.9% 的 shANXA2 MDA-MB-231 細胞在剪切應力下未能修復其膜，與沒有 Ca2+ 時對照細胞的值相似（圖2 C、E、F），在ANXA2沉默的AsPC-1細胞中也觀察到這種膜修復缺陷。電子顯微鏡觀察到大多數shANXA2 MDA-MB-231細胞似乎已經裂解，就像沒有Ca2+ 一樣。這些結果強烈表明，剪切應力會導致膜損傷，其修復需要ANXA2。

此外，實驗還檢查了抗-ANXA2抗體抑制膜修復的能力。研究假設抗體會通過被破壞的膜進入細胞，并通過中和 ANXA2 來抑制膜修復。對照 MDA-MB-231 細胞在 Ca2+ 和單克隆抗ANXA2抗體存在下承受剪切應力。結果觀察到，8.7% ± 3.0% 的未修復細胞，明顯高于在 Ca2+ 存在下受損的對照細胞的值，并推斷抗-ANXA2抗體的存在導致剪切應力后膜修復缺陷（圖2 D-F）�？�-ANXA2抗體在膜修復中的抑制作用在AsPC-1細胞中也得到證實。因此得出結論，ANXA2 是響應剪切應力的關鍵成分，并且抗-ANXA2 抗體盡管在細胞外給藥，但可以抑制膜修復。

圖2 對照和shANXA2 MDA-MB-231細胞對剪切應力下膜損傷的反應。

最后，研究人員使用transwell侵襲測定法討論了ANXA2沉默對MDA-MB-231和AsPC-1細胞遷移的影響（圖3 A ）。在沒有ANXA2的情況下，覆蓋有基質膠和膠原蛋白插入物的下腔室中的MDA-MB-231細胞數量分別減少了72% 和 62%（圖3 B）。類似的結果在AsPC-1細胞中觀察到。這表明，ANXA2 的缺失降低了 MDA-MB-231 和 AsPC-1 細胞的侵襲性。

此外，為了研究 ANXA2 在腫瘤進展中的作用，用熒光素酶報告基因標記對照和 shANXA2 MDA-MB-231 細胞，并將細胞注射到 NOD SCID 小鼠和RAG小鼠的尾靜脈中，發(fā)現缺乏ANXA2的細胞在肺部的定植效率要差得多，并且無法移植到骨骼中。這說明，ANXA2是小鼠轉移所必需的。為了確認 ANXA2 缺失細胞轉移的較低傾向，將對照或shANXA2 MDA-MB-231細胞和對照或shANXA2 AsPC-1細胞注射到斑馬魚幼蟲的卵黃囊中，并量化在魚尾部和/或頭部形成的轉移，也證實了ANXA2是斑馬魚細胞植入和轉移所必需的。

圖3 ANXA2缺乏會損害MDA-MB-231細胞的侵襲。

總之，該研究表明，膜聯蛋白-A2（ANXA2）是侵襲性乳腺癌和胰腺癌細胞膜修復所必需的。從機制上講，通過熒光和電子顯微鏡表明，當 ANXA2 沉默或被中和抗體抑制時，細胞無法重新密封剪切應力造成的損傷膜。沉默ANXA2對體外增殖沒有影響，甚至可能加速傷口愈合試驗中的遷移，但會減少小鼠和斑馬魚中的腫瘤細胞擴散。研究人員預測，抑制膜修復在對侵襲性、預后不良的腫瘤中特別有效，因為它們依靠膜修復機制在腫瘤侵襲和轉移期間來維持膜損傷。這可以通過抗-ANXA2抗體來實現，抗-ANXA2抗體已被證明可以抑制乳腺癌和胰腺癌細胞的轉移，也可以使用小分子藥物來實現。

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原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38092984/

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