MCF腫瘤細胞球狀體與HUVEC細胞在流體環(huán)境下共培養(yǎng)實驗機制詳解

前言

為了模擬腫瘤及其微環(huán)境的復雜三維結構特征，三維腫瘤細胞球狀體模型已成為不可或缺的體外研究模型系統(tǒng)。本方案詳細闡述了利用 µ-Slide I Luer 3D 通道載玻片（87176，ibidi），在膠原蛋白 I 基質中共培養(yǎng)腫瘤細胞球狀體與內(nèi)皮細胞（人臍靜脈內(nèi)皮細胞，即 HUVECs）的實驗方法。此外，該模型支持通過灌流培養(yǎng)技術來模擬體內(nèi)生理條件，為深入研究腫瘤血管生成機制及轉移過程提供了有力工具。

圖 1：灌流共培養(yǎng)示意圖。
 

1.實驗材料：

請注意！本實驗方案針對 MCF 腫瘤細胞球狀體以及 HUVEC 細胞進行了優(yōu)化；當使用其他細胞球狀體或內(nèi)皮細胞進行實驗時，請對試劑和緩沖液進行適當調整。

1.1試劑與緩沖液：

• 人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC，12203，Promocell）

• MCF-7 腫瘤細胞球狀體（CLS訂單號：Cryovial 300273，330273）

• 皮細胞生長培養(yǎng)基（ECGM，Promocell，C-22010）

• 內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基 2（ECGM 2，Promocell，C-22011）

• 磷酸鹽緩沖液（14190144，Gibco）

• Accutase 細胞解離液（A1110501，Gibco）

• 大鼠尾源膠原蛋白 I，非胃蛋白酶處理，母液濃度 5 mg/mL（ibidi，50201），用 17.5 mM 乙酸溶液稀釋至 4 mg/mL；

• 10× RPMI 1640 培養(yǎng)基（Sigma，R1145）

• 1× RPMI 1640 培養(yǎng)基（Sigma，R8758）

• 培養(yǎng)基補充劑（如L-谷氨酰胺，根據(jù)細胞類型而定）

• 1 M 氫氧化鈉溶液（溶于超純水）

• 7.5% 碳酸氫鈉溶液（Sigma，S8761）

• 無菌超純水

1.2設備與耗材：

• µ-Slide I Luer 3D 通道載玻片，經(jīng) ibiTreat 表面處理（87176，ibidi）

• ibidi 流體剪切力系統(tǒng)（10902，ibidi），含灰色灌流管套裝（10968，ibidi）

• 標準細胞培養(yǎng)設備（超凈工作臺、細胞解離試劑盒、培養(yǎng)瓶、移液器、吸頭、培養(yǎng)皿等）

• 倒置顯微鏡

• 冰塊與冷卻架

 

請注意！為避免氣泡產(chǎn)生，灌流管套裝與培養(yǎng)基的脫氣處理至關重要。請在實驗前一天將灌流管套裝（不開封）以及細胞培養(yǎng)基（置于一小瓶中，并略微擰松瓶蓋）置于培養(yǎng)箱中進行脫氣

—只要包裝未開啟，上述用品即可保持無菌狀態(tài)。由于氣體在水和塑料材料中的溶解度會隨著溫度的變化而有所差異，因此這一步驟顯得尤為重要。具體而言，在高溫條件下，水和塑料 對氣體的吸收能力會減弱，相較于低溫條件下其吸收量會有所減少。

實驗步驟：

實驗者須在無菌條件下執(zhí)行以下步驟。

圖 2：實驗流程示意圖。
 

2.制備 3D 基質膠（載有細胞球狀體）

此共培養(yǎng)實驗的后續(xù)步驟需要先前生成的細胞球狀體——如需了解生成細胞球狀體的詳細步驟，請參閱以 下應用指南：

請點擊：細胞球狀體形成簡單的實驗方案

• 根據(jù)通道載玻片說明書中提供的相關指引，取出先前生成的球狀體，并在室溫層流罩下將細胞球狀體收集到一個試管中。

• 若需在基質膠中添加補充劑，則需將補充劑加入 1×細胞培養(yǎng)基中，并將其置于層流罩內(nèi)的冰塊上。

• 將所有余下成分以及一個足夠容納全部基質膠的無菌試管一同置于層流罩內(nèi)的冰上。

• 按照本文表 1 中列出的順序，將除膠原蛋白和細胞懸液以外的所有成分用移液器移入試管中（試管始終置于冰塊上），輕柔吹打混勻，然后重新放回至冰上。

移液凝膠時的注意事項：

α）務必使用預冷到 4 ℃ 的移液器吸頭對凝膠進行移液！

β）在制備層粘連蛋白-膠原蛋白 I 凝膠時，鑒于其高粘度特性，建議對包含層粘連蛋白與膠原蛋白 I 的所有操作步驟實施反向移液。其具體操作為：先將移液器按壓至預設的第二壓力點，使凝膠完全填充移液器吸頭；待分配凝膠時，僅達到第一壓力點即行釋放，此舉可確保移液管吸頭內(nèi)殘留的凝膠被排除，同時確保分配體積的精確度。另外，為優(yōu)化操作，可選用專為高粘度溶液設計的移液器，如 Eppendorf Visco 系列吸頭或 Gilson Microman E 型移液器，以提高工作效率。

γ）請?zhí)貏e注意，即便在 4°C 條件下，凝膠混合物在發(fā)生初步凝膠化前的可操作時間也僅限于大約 5 min，因此需嚴格控制操作時間以保證實驗效果。

• 查閱產(chǎn)品分析證書 (CoA)，了解特定批次產(chǎn)品的膠原蛋白濃度，隨后用 0.1 M 乙酸將大鼠尾源膠原蛋白 I 稀釋至 4.0 mg/mL，稀釋時需用移液器吹打混勻，其它詳情請參閱以下應用指南：

請注意！在稀釋膠原蛋白 I 之前，實驗者須將其反復吹打混勻，以形成均一溶液。

• 將膠原蛋白 I 加入至步驟 1- 中所制備的混合液中，在始終保持試管置于冰上的同時，將混合物上下吹打混勻；

• 將 MCF 腫瘤細胞球狀體懸液加入至上述混合液中（實驗者應在 50 μL 移液體積中移取盡可能多的細胞球狀體），隨后短暫渦旋以混合樣品；

• 至此，混合液已制備完畢，實驗者可將其移入 µ-Slide I Luer 3D 通道載玻片中；在移液過程中，載玻片須始終置于冰上；

• 請注意！為避免載玻片底部被冰塊劃傷，請先將載玻片置于一培養(yǎng)皿中，再將該培養(yǎng)皿置于冰上。

• 撕去附于載玻片上表面的保護箔，并在每個孔中加入16 µL 含有細胞球狀體的膠原蛋白 I 基質膠，操作時須避免產(chǎn)生氣泡；

• 將蓋玻片置于載玻片的粘性區(qū)域上，按壓蓋玻片以確保粘性區(qū)域妥善密封；

• 用隨附的蓋子覆蓋 Luer 接頭以保持其無菌狀態(tài)，并將載有基質膠的載玻片置于 37°C、5% CO2CO_2 培養(yǎng)箱中凝膠化 45 min；

• 凝膠化完畢后，用相差顯微鏡 10× 物鏡鏡檢膠原蛋白纖維。

表 1：使用大鼠尾源膠原蛋白 I 與 RPMI 1640 培養(yǎng)基制備基質膠的加樣方案，所有成分均按加樣順序列
 

3.接種內(nèi)皮細胞

實驗者須在無菌條件下執(zhí)行以下步驟。

• 如本文「設備與耗材」一節(jié)所述，若需使用 ibidi 流體剪切力系統(tǒng)進行灌流培養(yǎng)，實驗者需提前一天將灌流管套裝和內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基（ECGM 以及 ECGM 2 培養(yǎng)基）放入 37°C 培養(yǎng)箱中預熱；

• 使用 Accutase 細胞解離液解離 HUVEC 細胞 1~2 min；

• 收集細胞懸液，1000 rpm 離心 4 min，隨后用少量 ECGM 培養(yǎng)基重懸，以便計數(shù)；

• 對細胞進行計數(shù)，用適量 ECGM  培養(yǎng)基調整細胞密度至1.5×106cells/mL

• 用生物相容性 1 mL 注射器將約 250 μL 上述細胞懸液加入至載玻片通道中；

• 用標準吸頭從 Luer 接頭處吸去剩余細胞懸液，用隨附的蓋子覆蓋 Luer 接頭以保持其無菌狀態(tài)；

• 將載玻片連同一片無菌濕紙巾置于一培養(yǎng)皿中，隨后將該培養(yǎng)皿置于 37°C、5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育 2 h。

4. 連接到ibidi 流體剪切力系統(tǒng)進行細胞流體培養(yǎng)：

請注意！內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基 2 含有如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子（EGF） 等生長因子，這些生長因子能夠誘導細胞的遷移和萌芽生長。

• 孵育 2 h 完畢后，將載玻片與 ibidi 流體剪切力系統(tǒng)相連接，開始進行灌流培養(yǎng)；在灌流培養(yǎng)期間， 請按照使用說明書準備 ibidi 流體剪切力系統(tǒng)，并在儲液器中適量 ECGM2 培養(yǎng)基：

• 若需進行延時序列成像，請將載玻片放入顯微鏡載物臺上的培養(yǎng)腔室（如 ibidi 載物臺培養(yǎng)箱）中， 并開始延成像（如圖 3 所示）；若需進行單幀成像，請?zhí)崆霸O置顯微鏡參數(shù)，以盡可能縮短成像時間。不成像時，請將載玻片放回培養(yǎng)箱；若需進行終點分析，請在實驗結束時固定細胞，然后繼續(xù)染 色（詳見本文「染色」一節(jié)）或執(zhí)行下游方案。

圖 3：灌流培養(yǎng)條件下的延時成像實驗裝置示意圖。
 

5.活細胞相差成像示例

圖 4：基質膠上生長的細胞球狀體（A）對焦的相差鏡檢圖像與接種 2 h 后的 HUVEC 細胞（B）對焦的相差鏡檢圖像；C）在灌流培養(yǎng)條件下（流速約為 0.5 mL/min）共培養(yǎng) 3 d 后的細胞球狀體與 HUVEC 細胞。

6.染色：

6.1.材料

• 磷酸鹽緩沖液（14190144，Gibco）

• 即用型 10% 福爾馬林溶液（HT5011，Sigma Aldrich）

• Alexa Fluor 488 標記的抗 CD31 抗體（MA5-18135，Invitrogen）

• 鬼筆環(huán)肽-iFluor 647 染液（ab176758，Abcam）

• DAPI（D9542，Sigma Aldrich）

• Triton X-100 透化劑（A16046，Thermo Fisher Scientific）

• 破膜緩沖液（0.5% Triton X-100 透化劑，以磷酸鹽緩沖液稀釋）

• 封閉緩沖液（1% 牛血清白蛋白 + 0.2% Triton X-100 透化劑，以磷酸鹽緩沖液稀釋）

• 抗體稀釋緩沖液（1% 牛血清白蛋白 + 0.05% Triton X-100 透化劑，以磷酸鹽緩沖液稀釋）

• 牛血清白蛋白（A1470-10G，Sigma Aldrich）

6.2.染色步驟

• 為實驗制備足量破膜緩沖液與封閉緩沖液；

• 斷開載玻片與流體泵之間的連接；

• 用移液器由 Luer 接頭處吸出細胞培養(yǎng)基；

• 用 200 µL 磷酸鹽緩沖液輕柔洗滌細胞 2 次，具體方法為：在一側 Luer 接頭中加入磷酸鹽緩沖液， 直至觀察到液體由另一側 Luer 接頭處溢出；

• 用 10%福爾馬林替換磷酸鹽緩沖液以固定細胞：首先在 Luer接頭處吸去磷酸鹽緩沖液，隨后在Luer接頭中加入 200µL10%福爾馬林并令其流過載玻片通道，然后在 Luer接頭處吸去此 200μL10%福爾馬林，再在 Luer接頭中加入另外 200µL10%福爾馬林，并孵育細胞 15min；【 】

• 吸去福爾馬林，并用 100 µL 磷酸鹽緩沖液洗滌細胞 4 次；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 破膜緩沖液替換磷酸鹽緩沖液，并孵育細胞 10 min； 吸去破膜緩沖液，用 200 μL 磷酸鹽緩沖液洗滌細胞 2 次；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 封閉緩沖液替換磷酸鹽緩沖液，并孵育細胞 30 min； 在封閉期間，制備足量抗體稀釋緩沖液以稀釋一抗和二抗；

• 用抗體稀釋緩沖液中將標記的抗體（或一抗）以 1:100 體積比稀釋；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 一抗溶液替換封閉緩沖液，并 4°C 孵育細胞過夜；請注意！在以下步驟中，實驗者須盡可能地將樣品置于暗處，以避免光漂白效應。

• 用 200 µL 封閉緩沖液洗滌細胞 3 次；

• 在相同的抗體稀釋緩沖液中，將鬼筆環(huán)肽-iFluor 647 染液以 1：1000 體積比稀釋，將 DAPI 稀釋至

• 10 µg/mL；

• 按照與步驟 類似的方法，用 200 μL 二抗染液替換封閉緩沖液，并避光孵育 2 h； 用 200 µL 封閉緩沖液洗滌細胞 3 次；

• 按照與步驟 類似的方法，每通道用 200 μL 磷酸鹽緩沖液替換封閉緩沖液；

• 將載玻片在4°C下避光保存直至鏡檢——理想情況下，應立即進行成像，因為長時間保存可能會降低 圖像質量。

• 

圖 5：在灌流共培養(yǎng) 3 d 后，對細胞球狀體和 HUVEC 細胞進行染色；細胞核：DAPI（藍色），肌動蛋白絲：鬼筆環(huán)肽-iFluor 647（紅色），CD31（HUVEC特異性標記）：Alexa Fluor 488標記的抗CD31抗體（綠色）

 

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