GST標簽蛋白純化技術(shù)原理及常見問題解析

1988年，Smith（Royal Melbourne Hospital，Australia）和Johnson（University of Melbourne，Australia）首次提出谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）親和標簽的概念，這是一種可以一步獲得高純度目的蛋白的純化試驗方法。

此后，GST融合蛋白的親和純化法被廣泛使用，目前已成為純化重組蛋白的常用方法。而來源于日本吸血蟲的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標簽，則是現(xiàn)今應用最為廣泛的融合標簽之一。

GST標簽蛋白親和純化具有以下特點：
• 高純度目標蛋白一步純化
• 特異性強、純化條件溫和，完整保留了蛋白的生物活性
• 水溶性良好，可以促進外源蛋白可溶性表達
• 可用不同的蛋白酶去除親和標簽

Fig.1 GST標簽蛋白的晶體結(jié)構(gòu)
 

在純化過程中，帶有GST標簽的目標蛋白與瓊脂糖介質(zhì)上交聯(lián)的谷胱甘肽配體發(fā)生互補性結(jié)合。這種結(jié)合具有可逆性，可以在溫和、非變性的條件下通過在緩沖液中加入還原型谷胱甘肽洗脫下來，雜質(zhì)在結(jié)合過程中流穿或通過結(jié)合緩沖液被洗脫去除，實現(xiàn)目的蛋白的分離。

如純化后需將GST標簽去除，可以采用柱上或柱下酶切的方式。

如需柱上酶切，可以在標簽蛋白與谷胱甘肽結(jié)合時加入針對于蛋白酶位點的特異性酶切酶進行切割。如需柱下酶切，則可在洗脫之后再加入酶切酶進行酶切。一般可以根據(jù)選擇的表達載體使用PreScission Protease、Thrombin、 Factor Xa三種酶進行切除。

Fig.2  GST 標簽蛋白純化產(chǎn)品

• 純化緩沖液推薦：

平衡液：10-20mM PB/50-100mM Tris-HCl + 0.14-0.4M NaCl，pH6.2~8.0

洗脫液：50mM Tris-HCl+10-60mM 還原性谷胱甘肽，pH8.0~9.0

Tips：為提高純度可在結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液中加入還原劑，如1-5 mM DTT，但這樣可能會降低收率。
 

一般來說，使用親和層析一步純化出的GST標簽蛋白純度高于一步純化出的His標簽蛋白純度。但是，GST標簽蛋白在擁有眾多優(yōu)勢的同時，也存在兩點劣勢：1.分子量大，可能會影響蛋白質(zhì)功能和下游實驗；2.僅能純化可溶性蛋白。因此，純化時需根據(jù)純化的蛋白樣品性質(zhì)，選擇合適的層析填料進行純化。