蛋白降解技術(shù)AUTOTAC、第一代和第二代AUTAC的作用機(jī)制
01
蛋白降解技術(shù)
在蛋白降解技術(shù)中，目前最具開發(fā)潛力的是利用泛素化-蛋白酶體途徑的靶向降解技術(shù)，其代表技術(shù)為 PROTAC。但蛋白酶體系統(tǒng)并不適用于所有蛋白的降解，如與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的蛋白聚集體、較大體積的蛋白或非蛋白靶標(biāo)，如脂滴等。
除蛋白酶體降解系統(tǒng)之外，溶酶體降解系統(tǒng)也是真核細(xì)胞中重要的降解途徑。由于溶酶體含有多種酸性水解酶，可降解包括蛋白、核酸、脂質(zhì)在內(nèi)的多種物質(zhì)，很好地補(bǔ)充了蛋白酶體降解系統(tǒng)的不足。
圖 1. 基于自噬溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的自噬依賴靶向降解技術(shù)[1]。
(1) 以 PROTACs 和 AUTAC 為例，誘導(dǎo)感興趣目標(biāo) (TOIs) 和標(biāo)記機(jī)制之間的接近，向 TOI 添加易于自噬的標(biāo)簽，然后可以識(shí)別這些標(biāo)簽;(2)如 TPA 和AUTOTACs，直接向 TOIs 招募識(shí)別機(jī)器；(3) 利用上游自噬機(jī)制或調(diào)節(jié)因子作為 MOIs，在 TOIs 位點(diǎn)觸發(fā)自噬體的生物發(fā)生；(4) 以 ATTECs 為代表的策略四將 TOIs 和 mATG8s 結(jié)合在一起，將 TOIs 連接到一個(gè)吞噬體上。
目前基于溶酶體系統(tǒng)開發(fā)的靶向蛋白降解技術(shù)包括AUTAC (AUtophagy-TArgeting Chimera)，AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera)，ATTEC (Autophagosome-tethering compound) (詳見：ATTEC 分子: 通過自噬降解多靶點(diǎn)的閃亮新星！)等。其中 AUTAC 、AUTOTAC 及 ATTEC 是利用自噬-溶酶體降解機(jī)制進(jìn)行蛋白降解。
第一代/ 第二代 AUTAC & 第二代AUTOTAC
第一代 AUTAC 和第二代 AUTAC 既然都叫 AUTAC，所以降解機(jī)制是一樣的。
而 AUTAC 和 AUTOTAC 名字雖然很像，但二者從作用機(jī)制上還是存在差異的。AUTAC 是誘導(dǎo)底物打上泛素化標(biāo)簽，底物受體通過泛素化標(biāo)簽與底物結(jié)合，而 AUTOTAC 是直接將底物與底物受體結(jié)合起來。
由于基于自噬溶酶體系統(tǒng)的蛋白降解技術(shù)的開發(fā)基礎(chǔ)是選擇性自噬機(jī)制，所以首先我們先了解一下選擇性自噬的機(jī)制。
02
選擇性自噬機(jī)制
選擇性自噬機(jī)制主要包括兩個(gè)過程：底物識(shí)別和分離膜招募[1]。其機(jī)制如下：
- 底物識(shí)別: 底物受體與底物結(jié)合，主要有兩種方式：(1) 通過降解標(biāo)簽結(jié)合：識(shí)別機(jī)器 (底物受體，支架蛋白等) 結(jié)合底物表面的降解標(biāo)簽。(2) 直接結(jié)合：識(shí)別機(jī)器直接與底物結(jié)合。
- 分離膜招募: 大部分底物受體都通過結(jié)合分離膜表面的 mATG8 蛋白而招募分離膜。除上述機(jī)制外，一些底物受體以及支架蛋白還可招募上游自噬機(jī)器 (autophagy machinery) 及它們的調(diào)節(jié)蛋白，例如 ULK1 復(fù)合物與 BK1 等，以促進(jìn)在底物所在位置 (in situ，即原位) 形成分離膜。
圖 2. 選擇性自噬作用機(jī)制[1]。
在底物一端，一些識(shí)別機(jī)器結(jié)合特定的降解標(biāo)簽 (tag)，例如泛素、N-degron 或特定的糖鏈，這些標(biāo)簽可以被修飾在底物表面，也可以由底物內(nèi)部暴露出來；另一些底物受體可直接結(jié)合底物。在另一端，大部分底物受體都通過結(jié)合分離膜表面的 mATG8 蛋白而招募分離膜；除此之外，一些底物受體以及支架蛋白還可招募上游自噬機(jī)器 (autophagy machinery) 及它們的調(diào)節(jié)蛋白，例如 ULK1 復(fù)合物與 TBK1 等，以促進(jìn)在底物所在位置 (in situ，即原位) 形成分離膜。
03
AUTOTAC
AUTOTAC (AUTOphagy-TArgeting Chimera), 即自噬靶向嵌合體。AUTOTAC 包括三部分：目的蛋白配體、p62 靶向配體以及連接二者的 linker。
AUTOTAC 作用機(jī)制：
AUTOTAC 和 p62 的 ZZ 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使得原本無活性的 p62 構(gòu)象被激活誘導(dǎo)為自噬相容形式，暴露出 PB1 和 LIR 結(jié)構(gòu)域，PB1 和 LIR 分別可以促進(jìn) p62 與靶蛋白復(fù)合物的自聚集及其與自噬膜上 LC3 的相互作用，從而誘導(dǎo)靶蛋白經(jīng)過溶酶體降解[2]。其中p62就是一種底物受體，AUTOTAC通過將底物與受體連接，實(shí)現(xiàn)底物識(shí)別，進(jìn)而被降解，所以AUTOTAC 的機(jī)制是介導(dǎo)底物受體與底物的結(jié)合，即底物識(shí)別中的直接結(jié)合機(jī)制。
研究表明，利用 AUTOTAC 技術(shù)可成功在體外和體內(nèi)降解神經(jīng)退行性病變中的癌蛋白和蛋白質(zhì)聚集體。該技術(shù)的可行性為蛋白降解領(lǐng)域提供了一個(gè)新的策略。
研究人員首先針對(duì) p62 的 ZZ 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行 3D 建模，然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)和活性研究，最終確定了 YOK-2204、YOK-1304 和 YTK-105 三種化合物，之后通過 PEG linker 將 p62-ZZ 配體和靶蛋白配體連接合成多種 AUTOTAC，并驗(yàn)證了 AUTOTAC 不僅可以介導(dǎo)癌蛋白降解，還可以降解錯(cuò)誤折疊蛋白即蛋白聚集體的降解[2]。
與 PROTAC 相比，PROTAC 實(shí)現(xiàn)靶蛋白的有效降解和 Linker 長度及類型密切相關(guān)，但 AUTOTAC 的效果或許并不特別的依賴于 Linker 的長度，這為 AUTOTAC 設(shè)計(jì)提供了更多的靈活性[2]。
圖 4. 自噬靶向配體作用模式的模型 (a) 與自噬靶向配體的化學(xué)結(jié)構(gòu) (b) [2]。
04
AUTAC
AUTAC (AUtophagy-TArgeting Chimera) 主要由 3 部分組成，分別是靶蛋白配體、Linker 和降解標(biāo)簽鳥嘌呤衍生物 (GD)。
AUTAC 的作用原理：通過降解標(biāo)簽?zāi)M S-鳥苷酸化修飾，誘導(dǎo)靶蛋白的多聚泛素化，即給靶蛋白打上降解標(biāo)簽，識(shí)別機(jī)器通過降解標(biāo)簽與靶蛋白結(jié)合，實(shí)現(xiàn)底物識(shí)別。所以 AUTAC 機(jī)制不同于 AUTOTAC，是借助降解標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)底物識(shí)別。
AUTAC 具有更加廣泛的降解范圍，不僅可以降解細(xì)胞質(zhì)蛋白，還可以實(shí)現(xiàn)降解個(gè)頭較大的細(xì)胞器，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和過氧化物酶體等。
第一代 AUTAC
研究發(fā)現(xiàn)，在鏈球菌自噬清除過程中，S-鳥苷化在多泛素化過程中具有重要機(jī)制，然而具體的自噬機(jī)制仍然不清楚�；谥把芯勘尘�，第一代 AUTACs 選擇鳥嘌呤衍生物 (cGMP) 作為自噬標(biāo)簽來誘導(dǎo)內(nèi)源性 S-鳥苷酸化。所有報(bào)道的第一代 AUTAC 化合物均具有半胱氨酸作為亞結(jié)構(gòu)[3]。
第二代 AUTAC
第一代 AUTAC 的開發(fā)，主要集中在替代內(nèi)源性 S-鳥苷化中發(fā)現(xiàn)的磷酸化核糖結(jié)構(gòu)，因?yàn)?cGMP 的半胱氨酸亞結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致不必要的蛋白激酶 G (PKG) 激活。此外，環(huán)磷酸的負(fù)電荷可能會(huì)影響 AUTAC 細(xì)胞膜的通透性。
Hirokazu Arimoto 教授團(tuán)隊(duì)基于此前研究背景對(duì) AUTACs 進(jìn)行了結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系 (SAR) 研究，分別對(duì)第一代 AUTAC 鳥嘌呤部位及半胱氨酸部位用不同結(jié)構(gòu)進(jìn)行替換，發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤在 AUTAC 中發(fā)揮重要作用，而用吡唑環(huán)替代半胱氨酸可以明顯提高 AUTAC 活性。第二代 AUTAC 與第一代 AUTAC 相比，其活性提高了 100 倍[4]。
05
小結(jié)
AUTAC 與 AUTOTAC 都是利用自噬-溶酶體降解機(jī)制進(jìn)行蛋白降解，都是在底物識(shí)別階段介導(dǎo)蛋白降解，但具體的降解機(jī)制略有不同，AUTAC 是誘導(dǎo)底物打上泛素化標(biāo)簽，底物受體通過泛素化標(biāo)簽與底物結(jié)合，而 AUTOTAC 是直接將底物與底物受體結(jié)合起來。
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參考文獻(xiàn)：
[1] Yiqing Zhang, et al. Manipulating autophagic degradation in human diseases: from mechanisms to interventions. 5 July 2022; Accepted: 8 October 2022. Life Medicine, 2022, Volume 1.
[2] Ji CH, et al. The AUTOTAC chemical biology platform for targeted protein degradation via the autophagy-lysosome system. Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):904.
[3] Takahashi D, et al. AUTACs: Cargo-Specific Degraders Using Selective Autophagy. Mol Cell. 2019 Dec 5;76(5):797-810.e10.
[4] Takahashi D, et al. Second-Generation AUTACs for Targeted Autophagic Degradation. J Med Chem. 2023 Sep 14;66(17):12342-12372.
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