摘要：人端粒酶反轉錄酶（hTERT）基因電轉染大鼠前軟骨干細胞（PSCs）的效果及其對細胞增殖、分化等特性的影響。通過構建特定的電轉染體系，將 hTERT 基因導入大鼠 PSCs，利用多種檢測手段分析轉染后細胞在分子、細胞及功能層面的變化，為相關組織工程與再生醫(yī)學研究提供理論依據與實驗參考。
一、引言
前軟骨干細胞在骨骼發(fā)育與修復過程中具有重要作用，其增殖與分化能力影響著骨組織的形成與再生。然而，在體外培養(yǎng)及應用過程中，細胞往往面臨增殖能力受限、老化等問題。人端粒酶反轉錄酶基因與細胞的端粒維持及增殖能力密切相關。將 hTERT 基因導入大鼠前軟骨干細胞，有望改善細胞的增殖特性，并進一步探索其對分化能力的潛在調控作用，這對于骨組織工程領域中種子細胞的優(yōu)化具有重要意義。
二、材料與方法
（一）實驗材料
- 實驗動物：選取健康的新生大鼠，用于分離前軟骨干細胞。
- 主要試劑：包括用于細胞培養(yǎng)的高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等；構建 hTERT 基因表達載體所需的質粒提取試劑盒、限制性內切酶、連接酶等；電轉染試劑以及用于檢測細胞增殖、分化相關指標的抗體、試劑盒等。
（二）大鼠前軟骨干細胞的分離與培養(yǎng)
- 細胞分離：在無菌條件下，取新生大鼠的長骨組織，去除骨膜及周圍軟組織。將骨組織剪成小塊，置于含有適量消化酶的溶液中，在 37°C 下振蕩消化一定時間。消化完成后，通過離心收集細胞沉淀，用培養(yǎng)基重懸細胞，接種于培養(yǎng)皿中。
- 細胞培養(yǎng)：將接種后的細胞置于 37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞融合度達到一定比例時，進行傳代培養(yǎng)，選取生長狀態(tài)良好的第 2 - 3 代細胞用于后續(xù)實驗。
（三）hTERT 基因表達載體的構建
- 根據 hTERT 基因序列設計特異性引物，通過 PCR 技術擴增目的基因片段。
- 將擴增得到的 hTERT 基因片段與合適的載體質粒進行酶切處理，然后利用連接酶將兩者連接，構建重組表達載體。
- 將構建好的重組載體轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，通過篩選、鑒定獲得陽性克隆，提取重組質粒并進行純度與濃度檢測。
（四）電轉染實驗
- 細胞準備：取對數生長期的大鼠前軟骨干細胞，離心收集細胞，用預冷的電轉染緩沖液重懸細胞，調整細胞密度至合適濃度。
- 電轉染體系構建：將一定量的重組 hTERT 基因質粒與細胞懸液混合均勻，加入到電轉染杯中，設置合適的電轉染參數，如電壓、電容、脈沖時間等。
- 電轉染操作：將電轉染杯置于電轉儀中進行電脈沖處理，處理完成后，將細胞轉移至含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
（五）轉染后細胞的檢測與分析
- 基因表達檢測：采用實時熒光定量 PCR（qRT - PCR）技術檢測轉染后細胞中 hTERT 基因的 mRNA 表達水平，以未轉染細胞作為對照，分析基因轉染效率。
- 端粒酶活性檢測：利用端粒酶活性檢測試劑盒測定轉染后細胞的端粒酶活性變化，通過與未轉染細胞對比，評估 hTERT 基因對端粒酶活性的影響。
- 細胞增殖能力檢測：采用 CCK - 8 法檢測轉染后細胞在不同時間點的增殖情況，繪制細胞增殖曲線，觀察 hTERT 基因轉染對大鼠前軟骨干細胞增殖能力的改變。
- 細胞分化能力檢測：在特定的誘導分化條件下，培養(yǎng)轉染后的細胞，通過檢測成骨分化相關標志物（如堿性磷酸酶活性、骨鈣素表達等）以及成軟骨分化相關標志物（如 Aggrecan、Col2a1 表達等），分析 hTERT 基因轉染對細胞分化能力的影響。
三、結果
（一）hTERT 基因表達載體的鑒定
經過酶切鑒定與測序分析，證實成功構建了 hTERT 基因重組表達載體，其序列與預期一致，可用于后續(xù)電轉染實驗。
（二）電轉染效率及基因表達檢測
qRT - PCR 結果顯示，轉染后細胞中 hTERT 基因的 mRNA 表達水平顯著高于未轉染細胞，表明電轉染成功將 hTERT 基因導入大鼠前軟骨干細胞，且具有較高的轉染效率。
（三）端粒酶活性變化
端粒酶活性檢測結果表明，轉染 hTERT 基因后的大鼠前軟骨干細胞端粒酶活性明顯增強，與未轉染細胞相比具有顯著差異，說明導入的 hTERT 基因有效激活了細胞的端粒酶活性。
（四）細胞增殖能力
CCK - 8 法檢測的細胞增殖曲線顯示，轉染 hTERT 基因的大鼠前軟骨干細胞增殖速度明顯加快，在培養(yǎng)后期仍能保持較高的增殖活性，而未轉染細胞增殖逐漸減緩并趨于穩(wěn)定，表明 hTERT 基因轉染顯著提高了細胞的增殖能力。
（五）細胞分化能力
在成骨分化誘導條件下，轉染 hTERT 基因的細胞堿性磷酸酶活性及骨鈣素表達在一定時間內與未轉染細胞無明顯差異，但隨著培養(yǎng)時間延長，轉染細胞的成骨分化相關指標有升高趨勢；在成軟骨分化誘導條件下，轉染細胞的 Aggrecan 和 Col2a1 表達水平與未轉染細胞相比，在早期變化不顯著，后期有一定程度的增加，提示 hTERT 基因轉染對大鼠前軟骨干細胞的分化能力可能存在一定的延遲性影響。
四、討論
本研究成功地將人端粒酶反轉錄酶基因電轉染大鼠前軟骨干細胞，通過一系列檢測手段證實了轉染后細胞在基因表達、端粒酶活性、增殖能力等方面發(fā)生了顯著變化。在細胞分化能力方面，雖然早期影響不明顯，但后期出現的相關標志物表達變化表明 hTERT 基因可能在細胞分化進程中發(fā)揮著潛在的調控作用，其具體機制有待進一步深入研究。
電轉染技術作為一種高效的基因導入方法，在本實驗中展現出較好的效果，但在操作過程中，電轉染參數的優(yōu)化對于提高轉染效率和減少細胞損傷至關重要。此外，本研究為進一步探索 hTERT 基因修飾的前軟骨干細胞在骨組織工程中的應用提供了實驗基礎，例如在構建組織工程骨時，利用轉染后的細胞可能提高種子細胞的數量與活性，從而促進骨組織的再生與修復。然而，在將其應用于臨床實踐之前，還需要對細胞的安全性、免疫原性等多方面進行全面評估，以確保其在再生醫(yī)學領域的有效性與可行性。
綜上所述，本研究的成果為骨組織工程領域中前軟骨干細胞的基因修飾研究提供了有價值的參考，有望推動相關領域在細胞治療與組織再生方面取得進一步的發(fā)展。
