細胞培養(yǎng)基配制與傳代換液實驗操作流程及注意事項

1. 實驗前準備
1.1 實驗材料
細胞類型：口腔腫瘤細胞系
培養(yǎng)基：DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）
補充成分：10%胎牛血清（FBS），1%雙抗PIS
細胞培養(yǎng)器具：六孔板、超凈工作臺、CO₂培養(yǎng)箱

1.2 準備基礎培養(yǎng)基（50ml）
取適量的DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium，44.5ml）。
根據需要，添加10%胎牛血清（5ml）和1%青霉素-鏈霉素（0.5ml）。

1.3 過濾滅菌
將培養(yǎng)基通過0.22 μm的過濾器過濾滅菌，避免細菌和真菌污染。

1.4 儲存
將配制好的培養(yǎng)基分裝到無菌的試管中，貼上標簽并存放于4℃冷藏。

2. 實驗中步驟
2.1 實驗材料準備
培養(yǎng)基：DMEM（添加10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素）。
試劑：0.15%胰蛋白酶（用于消化細胞），PBS（磷酸鹽緩沖液）。
細胞培養(yǎng)器具：六孔板、超凈工作臺、CO₂培養(yǎng)箱。

2.2 細胞觀察
使用JuLI系列成像儀觀察細胞狀態(tài)，確保達到80-90%融合度，且無明顯污染。
若融合度較低，進行細胞換液即可，讓細胞再生長。

2.3 準備新培養(yǎng)基
預熱新鮮培養(yǎng)基至37℃。

2.4 細胞清洗：
吸去舊培養(yǎng)基，加入適量PBS（約1 ml），輕輕搖晃以清洗細胞。

2.5 細胞消化
加入適量的0.15%胰蛋白酶溶液（約0.5-1 ml），輕輕搖勻。
將細胞放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，置于成像儀下觀察細胞是否開始脫落。

2.6 停止消化，細胞收集
當細胞開始脫落時，立即加入等體積的新鮮培養(yǎng)基（1ml）以停止消化。
輕輕吹打皿底以確保細胞完全脫落。
將細胞懸液轉移至離心管中，離心1000 rpm，5分鐘。

2.7 去除上清液，細胞重懸
小心去除離心后的上清液，保留細胞沉淀。
使用新鮮培養(yǎng)基重懸細胞，輕輕吹打均勻。

2.8 接種新培養(yǎng)瓶/皿并培養(yǎng)
按照預定細胞密度（如1×10⁴至1×10⁵細胞/ml）接種至新的培養(yǎng)瓶/皿中。
將接種好的細胞放入37℃、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

Tips：
1. 傳代頻率：通常每3-5天進行一次傳代，具體根據細胞生長情況調整。
2. 無菌操作：確保所有操作在無菌環(huán)境中進行，以減少污染風險。
3. 使用胰酶消化細胞要把握好時間，切勿消化過度。也可借助成像儀觀察細胞形態(tài)以掌握消化程度。
4. 細胞狀態(tài)監(jiān)測：定期檢查細胞生長和健康狀況。