微量WGBS應用：揭示卵巢早衰的人卵丘細胞DNA甲基化與表觀基因組圖譜
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早發(fā)性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency，POI）（亦稱卵巢早衰），是指女性在40歲之前卵巢功能下降，表現(xiàn)為促性腺激素水平升高和雌激素水平降低，甚至出現(xiàn)閉經(jīng)。POI病因復雜，約76.5%的病例無法通過遺傳變異解釋，越來越多的研究表明，生理、心理和環(huán)境因素可能通過誘導表觀遺傳變化（如DNA甲基化和羥甲基化）來影響基因表達，進而導致POI。盡管已有研究關(guān)注單個基因的表觀遺傳變化對卵巢功能的調(diào)控，但目前缺乏對POI患者整體表觀遺傳特征的全面了解。
近日，西安交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院/西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心副主任醫(yī)師施文浩博士為第一作者，西安交通大學基礎(chǔ)醫(yī)學院黃辰教授為通訊作者，以《Epigenomic Landscape of Human Cumulus Cells in Premature Ovarian Insufficiency Using Single-Base Resolution Methylome and Hydroxymethylome》為題在《Journal of Cellular and Molecular Medicine》期刊發(fā)表研究論文。研究通過單堿基分辨率的DNA甲基化組和DNA羥甲基化組分析，探討了POI患者人卵丘細胞（cumulus cells）的表觀基因組特征，并進一步揭示這些表觀遺傳修飾變化與POI相關(guān)基因、卵巢功能基因以及表觀遺傳時鐘基因的相關(guān)性。
標題：Epigenomic Landscape of Human Cumulus Cells in Premature Ovarian Insufficiency Using Single-Base Resolution Methylome and Hydroxymethylome（使用單堿基分辨率甲基化組和羥甲基化組觀察早發(fā)性卵巢功能不全中人卵丘細胞的表觀基因組圖譜）
發(fā)表時間：2024-12-20
發(fā)表期刊：Journal of Cellular and Molecular Medicine
影響因子： IF 5.3
技術(shù)平臺：微量WGBS、ACE-seq、Target-BS、Smart-seq2
本研究通過整合甲基化、羥甲基化和轉(zhuǎn)錄組測序分析，揭示POI患者卵丘細胞的表觀基因組特征，并探索其與卵巢功能的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，POI患者的甲基化和羥甲基化水平顯著升高，全基因組范圍內(nèi)表現(xiàn)出顯著高甲基化和高羥甲基化區(qū)域，其中Genebody（基因體）區(qū)域的甲基化水平與基因表達呈負相關(guān)，尤其是在啟動子區(qū)域。隨后作者通過實驗驗證了候選基因（EGR1、EGR2和DLX5）在卵巢類固醇激素合成中的作用。并進一步發(fā)現(xiàn)這些表觀遺傳修飾與POI相關(guān)基因、卵巢功能基因以及表觀遺傳時鐘基因存在相關(guān)性。這一全面的表觀遺傳分析通過揭示DNA表觀遺傳修飾與卵巢功能之間復雜相互作用，為識別POI新型生物標志物和治療靶點提供新方向。
研究方法
樣本收集：
研究納入在西北婦女兒童醫(yī)院生殖中心接受體外受精（IVF）治療的POI患者和對照組女性。POI患者年齡小于40歲，促卵泡生成素（FSH）水平高于20 mIU/mL，竇卵泡數(shù)少于5個，且既往有IVF失敗史。對照組為首次接受IVF治療、無POI的女性，因男性或輸卵管因素不孕，且預后良好（≥10個卵母細胞和≥5個高質(zhì)量第3天胚胎），年齡與POI組匹配。在IVF過程中，通過機械方法和透明質(zhì)酸酶處理分離卵母細胞周圍的卵丘細胞。
樣本測序：
微量全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）：通過亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶（T），從而檢測DNA甲基化。
APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測序（ACE-Seq）：一種無需亞硫酸鹽的單堿基分辨率5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）檢測方法。
微量轉(zhuǎn)錄組測序（Smart-seq2）：用于分析基因表達水平。
靶基因甲基化驗證（Target-BS/AmpBS）：驗證靶基因的甲基化水平。
DNA甲基化年齡檢測：
分析POI 致病基因、卵巢功能基因和表觀遺傳年齡時鐘中的甲基化水平。
結(jié)果圖形
（1）全基因組DNA甲基化（5mC）和DNA羥甲基化（5hmC）水平變化和分布
甲基化（5mC）：POI組的CG、CHG和CHH位點的甲基化水平顯著高于對照組，尤其是在基因啟動子區(qū)域和genebody區(qū)域。
羥甲基化（5hmC）：POI組的CpG位點的羥甲基化水平略高于對照組，而CHG和CHH位點的羥甲基化水平略低于對照組。整體上，POI組的羥甲基化水平在基因組重復元件、CpG島、基因啟動子和genebody區(qū)域顯著增加。
研究共鑒定出23234個DMRs（其中15389個為高甲基化區(qū)域，7845個為低甲基化區(qū)域）和3058個DhMRs（1892個為高羥甲基化區(qū)域，1166個為低羥甲基化區(qū)域）。這些區(qū)域在基因組中廣泛分布，且高甲基化/高羥甲基化區(qū)域顯著多于低甲基化/低羥甲基化區(qū)域。
（B）CG/CHG/CHH的整體甲基化平均率。
（C）小提琴圖展示了兩組間全基因組甲基化水平的分布密度。
（D–F）在基因組重復元件（短散在核元件SINEs、長散在核元件LINEs、長末端重復序列LTRs、低復雜性序列、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子、Satellite和簡單重復序列）中，人類基因組區(qū)域（CpG islands、CpG shelf 、CpG shore）以及轉(zhuǎn)錄起始位點上游2kb（up2k）、基因體（genebody）和轉(zhuǎn)錄終止位點下游2kb（down2k）的甲基化分布。
（G）差異甲基化區(qū)域（DMR）的數(shù)量，分為高甲基化（Hyper）和低甲基化（Hypo）類型。
（H）小提琴圖用于展示每組中不同基因組區(qū)間內(nèi)高甲基化和低甲基化DMR的分布密度。
（I-J）DMR在染色體和基因元件（3utr、5utr、外顯子、基因間區(qū)、內(nèi)含子、啟動子）上的分布。
（A）主成分分析（PCA）反映了羥甲基化特征的主要特點。
（B）CG/CHG/CHH的整體羥甲基化平均率。
（C）小提琴圖展示全基因組羥甲基化水平的分布密度。
（D–F）在基因組重復元件中，人類基因組區(qū)域以及轉(zhuǎn)錄起始位點上游2kb、genebody和轉(zhuǎn)錄終止位點下游20kb的羥甲基化分布。
（G）差異羥甲基化區(qū)域（DhMRs）的數(shù)量，分為高羥甲基化（Hyper）和低羥甲基化（Hypo）類型。
（H）小提琴圖展示每組中不同基因組區(qū)間內(nèi)高羥甲基化和低羥甲基化DhMR的分布密度。
（I-J）DhMR在染色體和基因元件上的分布。
（2）轉(zhuǎn)錄組RNA測序（Smart-seq2）數(shù)據(jù)分析
通過轉(zhuǎn)錄組RNA-Seq（Smart-seq2）分析，研究發(fā)現(xiàn)POI組與對照組之間有1257個差異表達基因（DEGs），其中628個上調(diào)，629個下調(diào)。GO和KEGG通路分析結(jié)果表明，POI組中與卵巢功能相關(guān)的基因表達顯著下調(diào)，包括細胞周期、染色體分離和類固醇合成等關(guān)鍵過程。
（B）所有組間差異表達基因的聚類熱圖分析。
（C）轉(zhuǎn)錄因子（TFs）家族分類。
（D-E）差異表達基因的GO和KEGG通路分析。
（F）基因集富集分析（GSEA）揭示前10通路中與卵巢相關(guān)的通路。
（3）候選基因的實驗驗證
研究進一步驗證了幾個關(guān)鍵基因（如EGR1、EGR2和DLX5）的甲基化水平、mRNA表達以及在卵巢類固醇激素合成中的作用。實驗結(jié)果表明，這些基因的甲基化水平與基因表達呈負相關(guān)，并且它們可能參與調(diào)節(jié)卵巢類固醇激素合成。
(B) 與 mRNA 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相比，9個 DEGs 表達的 RT-qPCR 驗證。
(C) CG位點甲基化矩陣繪制甲基化水平變化曲線。X軸表示序列中的核苷酸位置；Y軸包含兩個部分：上部顯示每個CG位點的甲基化水平，用點標記并擬合曲線以顯示趨勢；下部顯示CG位點的密度變化曲線。
(D) FSH處理對KGN細胞中EGR1表達的影響：(a) 對照組與FSH（0.5、1、1.5、2小時）組之間，p<0.0001；(b) 對照組與FSH（3小時）組之間，p=0.0093；(c) FSH（0.5小時）組與FSH（1小時）組之間，無顯著差異；(d) FSH（1小時）組與FSH（1.5小時）組之間，無顯著差異；(e) FSH（1.5小時）組與FSH（2小時）組之間，p<0.0001；(f) FSH（2小時）組與FSH（3小時）組之間，p<0.0001。
(E) FSH處理對KGN細胞中EGR2表達的影響：(a) 對照組與FSH（0.5、1、1.5小時）組之間，p<0.0001；
(b) 對照組與FSH（2小時）組之間，p=0.0002；(c) 對照組與FSH（3小時）組之間，無顯著差異；(d) FSH（0.5小時）組與FSH（1小時）組之間，無顯著差異；(e) FSH（1小時）組與FSH（1.5小時）組之間，p=0.0011；(f) FSH（1.5小時）組與FSH（2小時）組之間，p<0.0001；(g) FSH（2小時）組與FSH（3小時）組之間，p<0.0001。
(F) DLX5過表達對KGN細胞中雌二醇（Estradiol，E2）和孕酮（Progesterone，P）合成的影響：(a) 通過RT-PCR驗證KGN細胞中DLX5的過表達；(b) 在睪酮處理后，DLX5過表達的KGN細胞培養(yǎng)基中的雌二醇（E2）水平；(c) 在佛手柑處理后，DLX5過表達的KGN細胞培養(yǎng)基中的孕酮水平。
(G) DLX5敲低對KGN細胞中雌二醇和孕酮合成的影響：(a) 通過RT-PCR驗證KGN細胞中DLX5的敲低；(b) 在睪酮處理后，DLX5敲低的KGN細胞培養(yǎng)基中的雌二醇水平；(c) 在forskolin處理后，DLX5敲低的KGN細胞培養(yǎng)基中的孕酮水平。
（4）DNA甲基化/羥甲基化水平與基因表達的關(guān)系
研究發(fā)現(xiàn)，genebody甲基化水平與基因表達呈負相關(guān)，而啟動子區(qū)域的甲基化則表現(xiàn)出雙峰分布，低甲基化水平對應高表達，高甲基化水平對應低表達。然而，羥甲基化水平與基因表達之間未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。
（5）甲基化與POI相關(guān)基因、卵巢功能基因和表觀遺傳時鐘
研究還分析了POI相關(guān)基因、卵巢功能基因以及表觀遺傳時鐘CpG位點的甲基化差異。結(jié)果顯示，POI組在多個關(guān)鍵基因的甲基化水平上與對照組存在顯著差異，且這些基因的轉(zhuǎn)錄組表達水平也發(fā)生了顯著變化。此外，通過四種表觀遺傳年齡預測模型分析，POI組的表觀遺傳年齡可能高于對照組。
易小結(jié)
本研究首次在單堿基水平上分析了POI患者卵泡膜細胞的DNA甲基化和羥甲基化特征，揭示了POI患者基因組中廣泛的高甲基化和高羥甲基化現(xiàn)象。這些表觀遺傳修飾可能通過影響基因表達，進而影響卵巢功能。研究結(jié)果為識別POI的潛在生物標志物和治療靶點提供了新的線索，并強調(diào)了表觀遺傳修飾在POI發(fā)病機制中的潛在作用。
在本研究中，全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）和APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測序（ACE-seq）是兩種關(guān)鍵的測序技術(shù)，分別用于分析DNA甲基化和羥甲基化，它們在揭示POI的表觀遺傳機制中發(fā)揮了重要作用。
WGBS（全基因組亞硫酸鹽測序）
在本研究中，WGBS用于比較POI患者和對照組卵丘細胞細胞的全基因組甲基化水平。研究發(fā)現(xiàn)，POI患者的基因組整體甲基化水平顯著升高，尤其是在基因啟動子區(qū)域和genebody區(qū)域。這種高甲基化狀態(tài)可能抑制基因表達，進而影響卵巢功能。
此外，研究者通過WGBS鑒定出大量DMRs，這些區(qū)域在POI患者中表現(xiàn)出高甲基化或低甲基化。這些DMRs的鑒定為理解POI的表觀遺傳機制提供了重要線索。
ACE-seq（APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測序）
與甲基化類似，羥甲基化也在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。在本研究中，ACE-seq在單堿基分辨率下揭示了POI患者基因組中羥甲基化的整體變化，尤其是在基因組重復元件、CpG島和基因啟動子區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，POI患者的羥甲基化水平在某些區(qū)域顯著升高，可能與基因表達的調(diào)控有關(guān)。
此外，研究者通過ACE-seq鑒定出DhMRs，這些區(qū)域在POI患者中表現(xiàn)出高羥甲基化或低羥甲基化。進一步豐富了對POI表觀遺傳機制的理解。
WGBS和ACE-seq的協(xié)同作用
WGBS和ACE-seq的結(jié)合使用允許研究者同時分析DNA甲基化和羥甲基化，揭示這兩種表觀遺傳修飾在基因調(diào)控中的協(xié)同作用。如研究發(fā)現(xiàn)基因體的高甲基化與基因表達的抑制呈負相關(guān)，而羥甲基化的變化則可能與基因表達的激活或抑制有關(guān)。
通過整合這兩種技術(shù)的數(shù)據(jù)，研究者構(gòu)建出POI患者卵丘細胞的全面表觀遺傳圖譜。不僅揭示了POI的潛在致病機制，還為開發(fā)新的生物標志物和治療靶點提供了重要的基礎(chǔ)。
此外，結(jié)合WGBS和ACE-seq和RNA-seq的數(shù)據(jù)，研究者能夠進一步分析甲基化和羥甲基化與基因表達之間的關(guān)系。如研究發(fā)現(xiàn)某些基因的啟動子區(qū)域高甲基化與基因表達的下調(diào)密切相關(guān)，而genebody高甲基化也與基因表達抑制有關(guān)。
參考文獻：
Shi W, Wang D, Xue X, Qiao S, Zhang W, Shi J, Huang C. Epigenomic Landscape of Human Cumulus Cells in Premature Ovarian Insufficiency Using Single-Base Resolution Methylome and Hydroxymethylome. J Cell Mol Med. 2024 Dec;28(24):e70284. doi: 10.1111/jcmm.70284.
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