采用納米流式細(xì)胞術(shù)對(duì)血漿細(xì)胞外囊泡測(cè)試樣品的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)量

“細(xì)胞外囊泡”(EVs)是細(xì)胞自然釋放的細(xì)胞衍生顆粒與磷脂雙分子層。EVs存在于體液中，如血液和尿液。EVs的特性，如細(xì)胞起源、濃度、組成和功能是疾病依賴(lài)性的。因此，人們正在探索EVs作為疾病的生物標(biāo)志物，包括癌癥和心血管疾病。然而，為了將EVs作為生物標(biāo)志物，需要可靠和可重復(fù)的EVs測(cè)量方法。目前，EVs生物標(biāo)志物研究的主要障礙是儀器和不同單位之間測(cè)量結(jié)果的不可比性，這阻礙了多中心研究的建立。多中心研究是臨床生物標(biāo)志物研究的先決條件。

為了提高數(shù)據(jù)的可比性，本研究開(kāi)發(fā)具了有類(lèi)似EVs物理性質(zhì)的新參考材料和參考程序。新參考材料和參考程序的驗(yàn)證需要生物測(cè)試樣品。我們開(kāi)發(fā)了一種人血漿EVs測(cè)試樣品(PEVTES)，它i)類(lèi)似于血漿中的亞細(xì)胞顆粒，ii)是現(xiàn)成的，iii)與流式細(xì)胞儀兼容，iv)是穩(wěn)定的。方法:采用3例空腹供體血漿制備PEVTES。用血小板特異性(CD61)和紅細(xì)胞特異性(CD235a)抗原或乳黏附素抗體對(duì)EVs進(jìn)行免疫熒光染色。為了降低可溶性蛋白、脂蛋白和未結(jié)合試劑的濃度，通過(guò)大小排斥層析從血漿中分離染色的EVs。分離后，過(guò)濾PEVTES以去除殘余血小板。PEVTESs用冷凍保存劑、二甲亞砜（DMSO）、甘油或海藻糖稀釋?zhuān)��? 80℃保存12個(gè)月。解凍后，用校準(zhǔn)的納米流式細(xì)胞儀(Apogee A60-Micro)測(cè)量染色的EV濃度。

為了評(píng)估PEVTES穩(wěn)定性，在冷凍前和- 80◦c條件下保存1、3、6和12個(gè)月后，用流式細(xì)胞儀測(cè)量染色的EVs濃度，并對(duì)其流速、熒光信號(hào)和光散射信號(hào)進(jìn)行校準(zhǔn)。制備PEVTES的不同步驟的示意圖概述。步驟包括人血漿的收集和制備，染色程序，尺寸排除層析，用0.8 μm 孔徑大小的聚碳酸酯過(guò)濾器去除殘留的血小板，并通過(guò)添加不同的冷凍保存保存PEVTES（圖1）。

圖1.制備血漿細(xì)胞外囊泡(EV)檢測(cè)樣品(PEVTES)的實(shí)驗(yàn)流程。

用校正納米流式細(xì)胞儀(Apogee A60-Micro, Apogee flow Systems)測(cè)量(A)染色的人血漿和(B)儲(chǔ)存在(B)二甲亞砜(DMSO)、(C)甘油或(D)海藻糖中的凍融血漿EV測(cè)試樣品(PEVTES)的等效可溶性熒光色素(MESF)的直徑(nm)與熒光強(qiáng)度(異體藻藍(lán)蛋白(APC)分子)。紅色門(mén)表示免疫熒光染色(血小板來(lái)源)的EVs群體，可以根據(jù)散射信號(hào)從背景中區(qū)分出來(lái)(圖2)。

圖2. 流式細(xì)胞儀測(cè)量?jī)鋈谘獫{EV測(cè)試樣品(PEVTES)

與不涉及凍融循環(huán)的新鮮起始材料相比，在DMSO中保存12個(gè)月的CD61+ EVs的測(cè)量濃度下降了33%，在甘油中保存增加了9%，在海藻油中保存增加了6%，圖3A-C。為CD235a+ EVs的濃度圖3D-F所示的CD235a+ EV在DMSO、甘油和海藻糖中的濃度分別比新鮮起始材料降低約70%、23%和15%。圖3G-I所示，乳酸粘附素+EV的濃度在DMSO中分別下降23%，甘油中下降28%，海藻糖中下降19%(圖3)。

圖3. 血漿EV測(cè)試樣品(PEVTES)貯存期間的穩(wěn)定性檢測(cè)

 
結(jié)論

PEVTES 1)類(lèi)似于血漿中的亞細(xì)胞顆粒，2)易于使用，3)與納米流式細(xì)胞術(shù)兼容，4)穩(wěn)定性好。因此，開(kāi)發(fā)的PEVTES是驗(yàn)證新開(kāi)發(fā)的參考物和程序的理想候選物。

原文：Plasma extracellular vesicle test sample to standardize flowcytometry measurements

英國(guó)Apogee超靈敏納米流式分析儀，專(zhuān)為外泌體微囊泡（EVs）等小顆粒分析優(yōu)化設(shè)計(jì)，在EVs樣品顆粒大小分析，絕對(duì)定量，多標(biāo)記物同時(shí)快速分析工作中廣泛應(yīng)用。截止目前，該設(shè)備已累計(jì)參與數(shù)百篇高質(zhì)量同行審議文章相關(guān)實(shí)驗(yàn)分析工作。其出色的靈敏度，穩(wěn)定性及可靠性已備受業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可，并將繼續(xù)為EVs相關(guān)基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)支持。

Apogee納米流式除了可用于納米級(jí)別的顆粒 （如：細(xì)胞外囊泡、外泌體、微生物、病毒顆粒、LNP） 等，還可以用于作常規(guī)動(dòng)物細(xì)胞檢測(cè) （如免疫細(xì)胞、哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞、等）。它是一臺(tái)全面且功能強(qiáng)大的納米流式分析儀！

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