當(dāng)前位置 > 首頁(yè) > 技術(shù)文章 > RNA-BS揭示NONO蛋白通過(guò)調(diào)控mRNA的m5C修飾和可變剪切促進(jìn)醫(yī)學(xué)進(jìn)展
RNA-BS揭示NONO蛋白通過(guò)調(diào)控mRNA的m5C修飾和可變剪切促進(jìn)醫(yī)學(xué)進(jìn)展
RNA修飾如N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用。m5C修飾不僅存在于核糖體RNA和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA中，也在信使RNA（mRNA）中被檢測(cè)到，主要通過(guò)NSUN2催化，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。而PTEN是一個(gè)關(guān)鍵的腫瘤抑制基因（tumor suppressor genes，TSG），其表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、翻譯和后翻譯水平的調(diào)控。PTEN的可變剪切（alternative splicing，AS）在癌癥中被廣泛研究，但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。盡管已有研究關(guān)注m5C修飾對(duì)癌基因mRNA的影響，但對(duì)于其對(duì)腫瘤抑制基因（TSG）mRNA的影響及其調(diào)控機(jī)制知之甚少。
近日，西南大學(xué)資源昆蟲(chóng)高效養(yǎng)殖與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙蓋超博士等為第一作者，西南大學(xué)資源昆蟲(chóng)高效養(yǎng)殖與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室崔紅娟教授和廣西醫(yī)科大學(xué)Liping Zhong為共同通訊，揭示了在胃癌（GC）中，RNA結(jié)合蛋白NONO通過(guò)m5C修飾和可變剪切（AS）調(diào)控PTEN mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌進(jìn)展。研究通過(guò)分析m5C RNA甲基化測(cè)序（RNA-BS）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）等分析，揭示了NONO在胃癌中的作用機(jī)制，并提出了一個(gè)新的腫瘤抑制基因失活機(jī)制，即通過(guò)m5C修飾和相關(guān)的可變剪切介導(dǎo)調(diào)控。相關(guān)研究成果以《NONO regulates m5C modification and alternative splicing of PTEN mRNAs to drive gastric cancer progression》為題發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》期刊。
標(biāo)題：NONO regulates m5C modification and alternative splicing of PTEN mRNAs to drive gastric cancer progression（NONO調(diào)控PTEN mRNA的m5C修飾和可變剪切以驅(qū)動(dòng)胃癌進(jìn)展）
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影響因子：IF11.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：RNA-BisSeq（RNA-BS）、RNA-seq等
本研究分析了胃癌的組織微陣列（tissue microarrays）和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，重點(diǎn)關(guān)注RNA剪切和m5C調(diào)控因子。為了揭示NONO在胃癌（GC）中的作用，研究采用了RNA測(cè)序（RNA-seq）、m5C測(cè)序（RNA-Bis-Seq）、RNA免疫沉淀、RNA原位雜交以及NONO敲低細(xì)胞的Minigene報(bào)告基因分析。研究還利用CDX模型和人類組織微陣列驗(yàn)證了其臨床相關(guān)性。
對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)集的分析以及包含40例胃癌組織的組織微陣列的免疫組化檢測(cè)顯示，NONO在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，NONO在胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲方面具有正向調(diào)控作用。在機(jī)制上，NONO直接與PTEN pre-mRNA互作，并通過(guò)RNA識(shí)別基序（RNA-recognition motif，RRM）結(jié)構(gòu)域招募RNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2，從而改變PTEN pre-mRNA的mRNA甲基化模式。通過(guò)臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了NONO/NSUN2/PTEN軸在胃癌進(jìn)展中的致癌作用。
本研究揭示了NONO以m5C依賴性方式調(diào)控PTEN mRNA的可變剪切，導(dǎo)致胃癌中PTEN表達(dá)下調(diào)。闡明了NONO通過(guò)m5C修飾和相關(guān)可變剪切介導(dǎo)腫瘤抑制基因失活的新機(jī)制。
研究方法
細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：使用多種胃癌細(xì)胞系（MKN-45、HGC-27、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）、正常胃上皮細(xì)胞（GES-1）和人源胃癌細(xì)胞（GC-1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建NONO敲低細(xì)胞系。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：通過(guò)皮下注射和尾靜脈注射的方式，將GC細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移情況。
RNA測(cè)序與分析：通過(guò)RNA測(cè)序（RNA-Seq）分析NONO敲低對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，鑒定差異表達(dá)基因和可變剪切事件。
RNA-BisSeq（RNA-BS）：用于分析m5C修飾模式的變化，通過(guò)RNA-BS測(cè)序技術(shù)，研究NONO對(duì)PTEN mRNA m5C修飾的影響。
免疫共沉淀與RNA免疫沉淀：驗(yàn)證NONO與NSUN2的相互作用，以及它們對(duì)PTEN mRNA的結(jié)合情況。
Minigene報(bào)告基因分析：通過(guò)構(gòu)建包含PTEN外顯子5、內(nèi)含子5和外顯子6的Minigene報(bào)告基因，研究NONO對(duì)PTEN可變剪切的影響。
結(jié)果圖形
（1）NONO在癌癥中作為癌基因和PI3K-AKT信號(hào)調(diào)控因子
通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和組織微陣列的數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明NONO在胃癌組織中高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。
(B) 通過(guò)qRT-PCR和Western blot分析了非癌細(xì)胞系（GES-1）、4種胃癌細(xì)胞系（BGC-823、HGC-27、MKN-45和SGC-7901）以及一種患者來(lái)源的原代胃癌細(xì)胞（GC-1）中NONO mRNA的表達(dá)情況（n=3）。
(C) 在208例胃組織中，分析了接受初始治療后有無(wú)新腫瘤事件的患者中NONO mRNA的表達(dá)情況。
(D) 在447例胃組織中，根據(jù)TP53突變狀態(tài)分析了NONO mRNA的表達(dá)情況。
(E) 組織微陣列中NONO蛋白的免疫組化染色代表性圖像。
(F) 從Tumor Gastric Tan-192-fRMA-u133p2和Kaplan-Meier Plotter中獲得了NONO蛋白表達(dá)水平與生存率之間的相關(guān)性，并通過(guò)Kaplan-Meier（K-M）分析進(jìn)行了評(píng)估。
(G) NONO蛋白敲低后進(jìn)行Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。
(H) EdU實(shí)驗(yàn)確定NONO蛋白敲低下細(xì)胞的增殖情況。
(I) Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NONO蛋白敲低下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白水平的表達(dá)情況。
(J) Western blot分析以檢測(cè)NONO蛋白敲低細(xì)胞中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白水平的表達(dá)情況。
(B) KEGG通路富集分析展示差異表達(dá)基因（DEGs）在KEGG通路中的富集情況。
(C) GSEA富集圖展示在shGFP與shNONO MKN-45細(xì)胞中，PI3K信號(hào)通路基因集富集分析（GSEA）結(jié)果。
(D-E) Western blot分析檢測(cè)了在MKN-45和GC-1細(xì)胞中NONO蛋白敲低和過(guò)表達(dá)后，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
（2）NONO直接調(diào)控PTEN mRNA的可變剪切
RNA-Seq分析顯示，NONO敲低導(dǎo)致PTEN mRNA的剪切模式改變，增加了PTEN全長(zhǎng)mRNA的表達(dá)，減少了其他剪切變體的表達(dá)。
圖3：NONO蛋白直接調(diào)控PTEN mRNA的可變剪切。
(A) NONO蛋白敲低后MKN-45細(xì)胞中可變剪切事件定量分析。左側(cè)：對(duì)照組（shGFP）細(xì)胞中檢測(cè)到的可變剪切事件分布情況；右側(cè)：shNONO與shGFP細(xì)胞系之間可變剪切事件變化分布。
(B) NONO蛋白敲低后，MKN-45細(xì)胞中PTEN基因的RNA-seq reads比對(duì)情況的Sashimi圖可視化。
(C) qPCR分析NONO蛋白敲低后MKN-45和GC-1細(xì)胞中不同PTEN RNA的表達(dá)情況（n=3）。
(D) MKN-45細(xì)胞PTEN mRNA（紅色）的RNA原位雜交（FISH）和NONO蛋白（綠色）免疫熒光代表性圖像。
(E) RBPsuite預(yù)測(cè)NONO蛋白在PTEN mRNA上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)果。
(F) RNA-蛋白Pull-Down實(shí)驗(yàn)顯示NONO蛋白與PTEN mRNA之間的相互作用。
(G) 通過(guò)RIP-qPCR檢測(cè)GC細(xì)胞裂解液中不同PTEN mRNA種類與NONO蛋白之間的相互作用（n=3）。
（3）PTEN pre-mRNA的m5C模式受NONO介導(dǎo)的NSUN2招募影響
RNA-BS分析發(fā)現(xiàn)，NONO敲低導(dǎo)致PTEN mRNA的m5C修飾水平顯著降低，表明NONO通過(guò)NSUN2影響PTEN mRNA的m5C修飾。
圖4：NONO蛋白與NSUN2在胃癌中的相互作用。
(A) NONO蛋白表達(dá)與TCGA-ATAD中RNA m5C相關(guān)基因表達(dá)的相關(guān)性。
(B) TCGA-STAD中RNA m5C相關(guān)基因的表達(dá)水平。
(C) NONO蛋白和NSUN2在細(xì)胞核中共定位。
(D) NONO蛋白與NSUN2的相互作用。
(E) NONO蛋白和NSUN2在293FT細(xì)胞、MKN-45和GC-1細(xì)胞中的相互作用。
(F) NONO蛋白和NSUN2在293FT細(xì)胞、MKN-45和GC-1細(xì)胞中的相互作用。
(G-H) 檢測(cè)NONO蛋白與NSUN2相互作用所需的NONO蛋白功能域。
(I) GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)NONO蛋白與NSUN2相互作用所需的NONO蛋白功能域。
(J) 人類NONO蛋白-NSUN2復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。
(K) NONO蛋白的Q157和Y158突變消除了NONO蛋白與NSUN2之間的相互作用。
（B） 與匹配的低表達(dá)樣本相比，高表達(dá)m5C甲基化腫瘤中NONO或NSUN2蛋白表達(dá)的分布。
（C） 胃癌（GC）中不同m5C位點(diǎn)的分布。m5C位點(diǎn)的差異定義如下：平均m5C水平差異≥0.05（shNONO和shGFP）和p＜0.05（Wilcoxon檢驗(yàn)）。
（D） GC轉(zhuǎn)錄本中的m5C序列頻率標(biāo)志。
（E） 在MKN-45細(xì)胞系中，MeRIP-qPCR表明m5C抗體（up）沉淀了PTEN mRNA的富集，RIP qPCR表明NSUN2抗體（down）沉淀了PTENmRNA的富集。
（F） 整合基因組瀏覽器軌跡顯示shGFP和shNONO MKN-45細(xì)胞中PTEN的reads覆蓋率和m5C水平（左）。RBPsuite用于預(yù)測(cè)NONO和NSUN2沿PTEN內(nèi)含子5的結(jié)合位點(diǎn)（右）。
（G） Minigene實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NONO和NSUN2之間協(xié)調(diào)性。對(duì)照剪切報(bào)告基因（WT）和突變剪切報(bào)告基因的圖形表示（MUT：特異性地將突變引入NONO/NSUN2結(jié)合位點(diǎn)；綠色）（左）。對(duì)NONO敲除后的PTEN Minigenes進(jìn)行qRT-PCR分析（右）。
（H） Kaplan-Meier分析揭示NONO、NSUN2的高表達(dá)和PTEN低表達(dá)與較差總生存率（OS）之間的相關(guān)性。
（4）NONO/NSUN2/PTEN軸的調(diào)控機(jī)制——促進(jìn)GC進(jìn)展
通過(guò)免疫共沉淀、RNA免疫沉淀和Minigene報(bào)告基因分析，揭示了NONO通過(guò)其RNA識(shí)別基序（RRM）結(jié)構(gòu)域與NSUN2相互作用，進(jìn)而影響PTEN mRNA的m5C修飾和可變剪切。
B. 在NSUN2敲低后NONO蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
C. 在NSUN2敲低后NONO蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
D. 在NSUN2敲低后NONO蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。
E. 在胃癌異種移植瘤中，通過(guò)免疫組化（IHC）檢測(cè)NONO蛋白、PTEN、Ki67和m5C水平的表達(dá)。
F. 肺部的代表性圖像。
G. 肺部的代表性圖像。
H. 通過(guò)H&E染色觀察裸鼠肺部切片，這些裸鼠通過(guò)尾靜脈注射了NONO蛋白敲低的MKN-45細(xì)胞。右側(cè)顯示了每只動(dòng)物肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量（n=4）。
I. 在NONO蛋白敲低后恢復(fù)NSUN2表達(dá)的情況下，通過(guò)Western blot分析PTEN的表達(dá)。
J. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
K. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
L. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力（n=3）。
M. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，進(jìn)行MKN-45細(xì)胞的異種移植實(shí)驗(yàn)（n=6）。分析了腫瘤的重量，并給出了P值。
N. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，進(jìn)行MKN-45細(xì)胞的異種移植實(shí)驗(yàn)（n=6）。分析腫瘤重量。
O. 每只動(dòng)物肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量（n=4）。
易小結(jié)
本研究揭示了NONO通過(guò)m5C修飾和可變剪切調(diào)控PTEN mRNA表達(dá)的新機(jī)制，這一機(jī)制在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果不僅為理解腫瘤抑制基因失活提供了新的視角，還為胃癌診斷和治療提供了潛在靶點(diǎn)。
RNA-BisSeq（RNA-BS）在本研究中的作用
易基因提供的RNA-BisSeq（RNA-BS）技術(shù)在本研究中用于高分辨率地分析m5C修飾模式的變化。通過(guò)RNA-BS，研究人員能夠精確地檢測(cè)到PTEN mRNA上m5C修飾的變化，并確定這些變化與NONO表達(dá)水平的相關(guān)性。這一技術(shù)的應(yīng)用為揭示m5C修飾在腫瘤抑制基因調(diào)控中的作用提供了直接證據(jù)，是本研究的關(guān)鍵技術(shù)手段之一。
參考文獻(xiàn)：
Zhao G, Liu R, Ge L, Qi D, Wu Q, Lin Z, Song H, Zhong L, Cui H. NONO regulates m5C modification and alternative splicing of PTEN mRNAs to drive gastric cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2025 Mar 4;44(1):81. pii: 10.1186/s13046-024-03260-z. doi: 10.1186/s13046-024-03260-z.
近日，西南大學(xué)資源昆蟲(chóng)高效養(yǎng)殖與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙蓋超博士等為第一作者，西南大學(xué)資源昆蟲(chóng)高效養(yǎng)殖與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室崔紅娟教授和廣西醫(yī)科大學(xué)Liping Zhong為共同通訊，揭示了在胃癌（GC）中，RNA結(jié)合蛋白NONO通過(guò)m5C修飾和可變剪切（AS）調(diào)控PTEN mRNA表達(dá)，進(jìn)而影響胃癌進(jìn)展。研究通過(guò)分析m5C RNA甲基化測(cè)序（RNA-BS）、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）等分析，揭示了NONO在胃癌中的作用機(jī)制，并提出了一個(gè)新的腫瘤抑制基因失活機(jī)制，即通過(guò)m5C修飾和相關(guān)的可變剪切介導(dǎo)調(diào)控。相關(guān)研究成果以《NONO regulates m5C modification and alternative splicing of PTEN mRNAs to drive gastric cancer progression》為題發(fā)表于《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》期刊。
標(biāo)題：NONO regulates m5C modification and alternative splicing of PTEN mRNAs to drive gastric cancer progression（NONO調(diào)控PTEN mRNA的m5C修飾和可變剪切以驅(qū)動(dòng)胃癌進(jìn)展）
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research
影響因子：IF11.4/Q1
技術(shù)平臺(tái)：RNA-BisSeq（RNA-BS）、RNA-seq等
本研究分析了胃癌的組織微陣列（tissue microarrays）和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，重點(diǎn)關(guān)注RNA剪切和m5C調(diào)控因子。為了揭示NONO在胃癌（GC）中的作用，研究采用了RNA測(cè)序（RNA-seq）、m5C測(cè)序（RNA-Bis-Seq）、RNA免疫沉淀、RNA原位雜交以及NONO敲低細(xì)胞的Minigene報(bào)告基因分析。研究還利用CDX模型和人類組織微陣列驗(yàn)證了其臨床相關(guān)性。
對(duì)公開(kāi)數(shù)據(jù)集的分析以及包含40例胃癌組織的組織微陣列的免疫組化檢測(cè)顯示，NONO在胃癌中表達(dá)上調(diào)，并且與不良預(yù)后相關(guān)。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，NONO在胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲方面具有正向調(diào)控作用。在機(jī)制上，NONO直接與PTEN pre-mRNA互作，并通過(guò)RNA識(shí)別基序（RNA-recognition motif，RRM）結(jié)構(gòu)域招募RNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶NSUN2，從而改變PTEN pre-mRNA的mRNA甲基化模式。通過(guò)臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了NONO/NSUN2/PTEN軸在胃癌進(jìn)展中的致癌作用。
本研究揭示了NONO以m5C依賴性方式調(diào)控PTEN mRNA的可變剪切，導(dǎo)致胃癌中PTEN表達(dá)下調(diào)。闡明了NONO通過(guò)m5C修飾和相關(guān)可變剪切介導(dǎo)腫瘤抑制基因失活的新機(jī)制。
研究方法
細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：使用多種胃癌細(xì)胞系（MKN-45、HGC-27、SGC-7901、BGC-823、MGC-803）、正常胃上皮細(xì)胞（GES-1）和人源胃癌細(xì)胞（GC-1）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)構(gòu)建NONO敲低細(xì)胞系。
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：通過(guò)皮下注射和尾靜脈注射的方式，將GC細(xì)胞移植到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移情況。
RNA測(cè)序與分析：通過(guò)RNA測(cè)序（RNA-Seq）分析NONO敲低對(duì)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響，鑒定差異表達(dá)基因和可變剪切事件。
RNA-BisSeq（RNA-BS）：用于分析m5C修飾模式的變化，通過(guò)RNA-BS測(cè)序技術(shù)，研究NONO對(duì)PTEN mRNA m5C修飾的影響。
免疫共沉淀與RNA免疫沉淀：驗(yàn)證NONO與NSUN2的相互作用，以及它們對(duì)PTEN mRNA的結(jié)合情況。
Minigene報(bào)告基因分析：通過(guò)構(gòu)建包含PTEN外顯子5、內(nèi)含子5和外顯子6的Minigene報(bào)告基因，研究NONO對(duì)PTEN可變剪切的影響。
結(jié)果圖形
（1）NONO在癌癥中作為癌基因和PI3K-AKT信號(hào)調(diào)控因子
通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和組織微陣列的數(shù)據(jù)分析，結(jié)果表明NONO在胃癌組織中高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。
圖1：NONO蛋白在胃癌中作為癌基因和PI3K-AKT信號(hào)通路調(diào)控因子。
(A) 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，與正常胃組織（32例）相比，胃癌組織（375例）中NONO mRNA水平顯著增加。(B) 通過(guò)qRT-PCR和Western blot分析了非癌細(xì)胞系（GES-1）、4種胃癌細(xì)胞系（BGC-823、HGC-27、MKN-45和SGC-7901）以及一種患者來(lái)源的原代胃癌細(xì)胞（GC-1）中NONO mRNA的表達(dá)情況（n=3）。
(C) 在208例胃組織中，分析了接受初始治療后有無(wú)新腫瘤事件的患者中NONO mRNA的表達(dá)情況。
(D) 在447例胃組織中，根據(jù)TP53突變狀態(tài)分析了NONO mRNA的表達(dá)情況。
(E) 組織微陣列中NONO蛋白的免疫組化染色代表性圖像。
(F) 從Tumor Gastric Tan-192-fRMA-u133p2和Kaplan-Meier Plotter中獲得了NONO蛋白表達(dá)水平與生存率之間的相關(guān)性，并通過(guò)Kaplan-Meier（K-M）分析進(jìn)行了評(píng)估。
(G) NONO蛋白敲低后進(jìn)行Western blot和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。
(H) EdU實(shí)驗(yàn)確定NONO蛋白敲低下細(xì)胞的增殖情況。
(I) Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NONO蛋白敲低下細(xì)胞周期相關(guān)蛋白水平的表達(dá)情況。
(J) Western blot分析以檢測(cè)NONO蛋白敲低細(xì)胞中與轉(zhuǎn)移相關(guān)的蛋白水平的表達(dá)情況。
圖2：NONO蛋白通過(guò)PTEN在胃癌細(xì)胞中調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路。
(A) 火山圖展示基于shNONO與shGFP在MKN-45細(xì)胞中的對(duì)比，mRNA表達(dá)水平的變化倍數(shù)（以log2表示）。(B) KEGG通路富集分析展示差異表達(dá)基因（DEGs）在KEGG通路中的富集情況。
(C) GSEA富集圖展示在shGFP與shNONO MKN-45細(xì)胞中，PI3K信號(hào)通路基因集富集分析（GSEA）結(jié)果。
(D-E) Western blot分析檢測(cè)了在MKN-45和GC-1細(xì)胞中NONO蛋白敲低和過(guò)表達(dá)后，PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。
（2）NONO直接調(diào)控PTEN mRNA的可變剪切
RNA-Seq分析顯示，NONO敲低導(dǎo)致PTEN mRNA的剪切模式改變，增加了PTEN全長(zhǎng)mRNA的表達(dá)，減少了其他剪切變體的表達(dá)。
圖3：NONO蛋白直接調(diào)控PTEN mRNA的可變剪切。
(B) NONO蛋白敲低后，MKN-45細(xì)胞中PTEN基因的RNA-seq reads比對(duì)情況的Sashimi圖可視化。
(C) qPCR分析NONO蛋白敲低后MKN-45和GC-1細(xì)胞中不同PTEN RNA的表達(dá)情況（n=3）。
(D) MKN-45細(xì)胞PTEN mRNA（紅色）的RNA原位雜交（FISH）和NONO蛋白（綠色）免疫熒光代表性圖像。
(E) RBPsuite預(yù)測(cè)NONO蛋白在PTEN mRNA上的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)果。
(F) RNA-蛋白Pull-Down實(shí)驗(yàn)顯示NONO蛋白與PTEN mRNA之間的相互作用。
(G) 通過(guò)RIP-qPCR檢測(cè)GC細(xì)胞裂解液中不同PTEN mRNA種類與NONO蛋白之間的相互作用（n=3）。
（3）PTEN pre-mRNA的m5C模式受NONO介導(dǎo)的NSUN2招募影響
RNA-BS分析發(fā)現(xiàn)，NONO敲低導(dǎo)致PTEN mRNA的m5C修飾水平顯著降低，表明NONO通過(guò)NSUN2影響PTEN mRNA的m5C修飾。
圖4：NONO蛋白與NSUN2在胃癌中的相互作用。
(B) TCGA-STAD中RNA m5C相關(guān)基因的表達(dá)水平。
(C) NONO蛋白和NSUN2在細(xì)胞核中共定位。
(D) NONO蛋白與NSUN2的相互作用。
(E) NONO蛋白和NSUN2在293FT細(xì)胞、MKN-45和GC-1細(xì)胞中的相互作用。
(F) NONO蛋白和NSUN2在293FT細(xì)胞、MKN-45和GC-1細(xì)胞中的相互作用。
(G-H) 檢測(cè)NONO蛋白與NSUN2相互作用所需的NONO蛋白功能域。
(I) GST Pull-Down實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)NONO蛋白與NSUN2相互作用所需的NONO蛋白功能域。
(J) 人類NONO蛋白-NSUN2復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)。
(K) NONO蛋白的Q157和Y158突變消除了NONO蛋白與NSUN2之間的相互作用。
圖5：PTEN mRNA上的m5C模式受NONO和NSUN2的影響。
（A） 組織微陣列中m5C甲基化免疫組織化學(xué)染色的代表性圖像（左）以及不同階段腫瘤和正常組織之間m5C甲基化的差異水平。（B） 與匹配的低表達(dá)樣本相比，高表達(dá)m5C甲基化腫瘤中NONO或NSUN2蛋白表達(dá)的分布。
（C） 胃癌（GC）中不同m5C位點(diǎn)的分布。m5C位點(diǎn)的差異定義如下：平均m5C水平差異≥0.05（shNONO和shGFP）和p＜0.05（Wilcoxon檢驗(yàn)）。
（D） GC轉(zhuǎn)錄本中的m5C序列頻率標(biāo)志。
（E） 在MKN-45細(xì)胞系中，MeRIP-qPCR表明m5C抗體（up）沉淀了PTEN mRNA的富集，RIP qPCR表明NSUN2抗體（down）沉淀了PTENmRNA的富集。
（F） 整合基因組瀏覽器軌跡顯示shGFP和shNONO MKN-45細(xì)胞中PTEN的reads覆蓋率和m5C水平（左）。RBPsuite用于預(yù)測(cè)NONO和NSUN2沿PTEN內(nèi)含子5的結(jié)合位點(diǎn)（右）。
（G） Minigene實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證NONO和NSUN2之間協(xié)調(diào)性。對(duì)照剪切報(bào)告基因（WT）和突變剪切報(bào)告基因的圖形表示（MUT：特異性地將突變引入NONO/NSUN2結(jié)合位點(diǎn)；綠色）（左）。對(duì)NONO敲除后的PTEN Minigenes進(jìn)行qRT-PCR分析（右）。
（H） Kaplan-Meier分析揭示NONO、NSUN2的高表達(dá)和PTEN低表達(dá)與較差總生存率（OS）之間的相關(guān)性。
（4）NONO/NSUN2/PTEN軸的調(diào)控機(jī)制——促進(jìn)GC進(jìn)展
通過(guò)免疫共沉淀、RNA免疫沉淀和Minigene報(bào)告基因分析，揭示了NONO通過(guò)其RNA識(shí)別基序（RRM）結(jié)構(gòu)域與NSUN2相互作用，進(jìn)而影響PTEN mRNA的m5C修飾和可變剪切。
圖6：NONO蛋白通過(guò)m5C依賴性機(jī)制促進(jìn)胃癌發(fā)病。
A. 在NSUN2敲低后恢復(fù)NONO蛋白表達(dá)的情況下，通過(guò)Western blot分析PTEN的表達(dá)。B. 在NSUN2敲低后NONO蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
C. 在NSUN2敲低后NONO蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
D. 在NSUN2敲低后NONO蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。
E. 在胃癌異種移植瘤中，通過(guò)免疫組化（IHC）檢測(cè)NONO蛋白、PTEN、Ki67和m5C水平的表達(dá)。
F. 肺部的代表性圖像。
G. 肺部的代表性圖像。
H. 通過(guò)H&E染色觀察裸鼠肺部切片，這些裸鼠通過(guò)尾靜脈注射了NONO蛋白敲低的MKN-45細(xì)胞。右側(cè)顯示了每只動(dòng)物肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量（n=4）。
I. 在NONO蛋白敲低后恢復(fù)NSUN2表達(dá)的情況下，通過(guò)Western blot分析PTEN的表達(dá)。
J. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
K. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。
L. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力（n=3）。
M. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，進(jìn)行MKN-45細(xì)胞的異種移植實(shí)驗(yàn)（n=6）。分析了腫瘤的重量，并給出了P值。
N. 在NONO蛋白敲低后NSUN2過(guò)表達(dá)的情況下，進(jìn)行MKN-45細(xì)胞的異種移植實(shí)驗(yàn)（n=6）。分析腫瘤重量。
O. 每只動(dòng)物肺部結(jié)節(jié)的數(shù)量（n=4）。
易小結(jié)
本研究揭示了NONO通過(guò)m5C修飾和可變剪切調(diào)控PTEN mRNA表達(dá)的新機(jī)制，這一機(jī)制在胃癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究結(jié)果不僅為理解腫瘤抑制基因失活提供了新的視角，還為胃癌診斷和治療提供了潛在靶點(diǎn)。
RNA-BisSeq（RNA-BS）在本研究中的作用
易基因提供的RNA-BisSeq（RNA-BS）技術(shù)在本研究中用于高分辨率地分析m5C修飾模式的變化。通過(guò)RNA-BS，研究人員能夠精確地檢測(cè)到PTEN mRNA上m5C修飾的變化，并確定這些變化與NONO表達(dá)水平的相關(guān)性。這一技術(shù)的應(yīng)用為揭示m5C修飾在腫瘤抑制基因調(diào)控中的作用提供了直接證據(jù)，是本研究的關(guān)鍵技術(shù)手段之一。
參考文獻(xiàn)：
Zhao G, Liu R, Ge L, Qi D, Wu Q, Lin Z, Song H, Zhong L, Cui H. NONO regulates m5C modification and alternative splicing of PTEN mRNAs to drive gastric cancer progression. J Exp Clin Cancer Res. 2025 Mar 4;44(1):81. pii: 10.1186/s13046-024-03260-z. doi: 10.1186/s13046-024-03260-z.
標(biāo)簽：
m5C甲基化測(cè)序
- 商業(yè)化基因合成的發(fā)展歷程、趨勢(shì)和人工智能創(chuàng)新
- RNA-BS揭示NONO蛋白通過(guò)調(diào)控mRNA的m5C修飾和可變剪切促進(jìn)醫(yī)學(xué)進(jìn)展
- WGBS揭示AtSAMS通過(guò)DNA甲基化植物花器官發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制
- 合成生物學(xué)：從 ”讀懂生命” 到 “創(chuàng)造生命” 的第三次生物革命
- m5C RNA甲基化測(cè)序（m5C MeRIP-seq）技術(shù)介紹與應(yīng)用
- RRBS等分析揭示同卵雙生子與腎小球?yàn)V過(guò)率相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)
- WGBS+ChIP-seq技術(shù)揭示Cdx2轉(zhuǎn)錄因子在發(fā)育與穩(wěn)態(tài)中的動(dòng)態(tài)結(jié)合機(jī)制
- 宏基因組學(xué)揭示豬糞與土壤中抗菌藥物抗性基因與金屬抗性基因的共存
- 2025伯豪生物春季全國(guó)巡講開(kāi)啟，早鳥(niǎo)報(bào)名搶占先機(jī)
- 華大智造副總裁中國(guó)區(qū)總經(jīng)理彭歡歡一行到訪伯豪生物
- 伯豪董事長(zhǎng)出席專精特新中小企業(yè)發(fā)展壯大論壇并發(fā)言
- 伯豪生物雙11狂歡特惠活動(dòng)來(lái)襲，限時(shí)限量搶
- 怡美通德推出成本價(jià)體驗(yàn)單細(xì)胞測(cè)序（FFPE或全血）
- 伯豪生物2024系列培訓(xùn)班（陜西站）報(bào)名開(kāi)啟
- 伯豪單細(xì)胞Flex年中巨惠，1.1W/樣本活動(dòng)價(jià)即將截止
- 藍(lán)景科信DAP-seq技術(shù)相關(guān)文章6連發(fā)，總IF 95.2
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網(wǎng) 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com