原代細胞分離培養(yǎng)實驗步驟及注意事項盤點
原代細胞（Primary cells）是指直接從機體取出的組織或細胞獲得單個細胞并在體外進行培養(yǎng)的細胞。組織主要指組織器官、外周血及胚胎等。由于原代細胞生長緩慢，繁殖一定的代數停止生長（一般10代以內）。
一、各類組織的取材技術：
1、 皮膚和粘膜的取材
主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般2~4平方厘米。
2、內臟和實體瘤的取材
內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。
3、血液細胞的取材
血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞，取材時應注意抗凝。
4、 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材
嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。
5、動物組織取材
I、鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
II、幼鼠胚腎(或肺)取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
6、雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟
1）、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
2）、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;
經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;
3）、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;
4）、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。
二、原代細胞與細胞系的區(qū)別
三、原代細胞分離培養(yǎng)
取材--分離--培養(yǎng)--鑒定
首先將組織從機體中取出，經胰蛋白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。
四、實驗步驟：
1.取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。
2.在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。
3.將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。
4.用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
5.大腦皮質放于DMEM中(含慶大霉素和谷氨酰胺 )，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。
6.室溫1 000×g離心8min，去上清液。
7.沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
8.沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
9.沉淀加入2ml DMEM(含慶大霉素和谷氨酰胺)培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
10.靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。
加入DMEM完全培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。
一、各類組織的取材技術：
1、 皮膚和粘膜的取材
主要取自于手術過程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術操作，但面積一般2~4平方厘米。
2、內臟和實體瘤的取材
內臟除消化道外基本是無菌的，但取材時要明確和熟悉所需組織的類型和部位，實體瘤取材時要取腫瘤細胞豐富的區(qū)域，要避開破潰、壞死液化部分，以防污染，盡量去除混雜的結締組織。
3、血液細胞的取材
血細胞、淋巴細胞的取材，一般多抽取靜脈外周血，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結等)分離細胞，取材時應注意抗凝。
4、 骨髓、羊水、胸/腹水細胞取材
嚴格無菌，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng)，離心后，用無鈣、鎂PBS洗兩次，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng)，不宜低溫存放。
5、動物組織取材
I、鼠胚組織取材
首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動物，然后將其整個浸泡在含有75%酒精的燒杯中，5分鐘后(注意時間不能太長，以避免酒精從口或其他通道進入體內，影響組織活力)，取出動物，在消毒過的木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢，切開皮膚，用無菌操作法解剖取胚或用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側皮膚拉向頭尾，把動物反包，暴露軀干，然后再固定，更換無菌解剖器材，采用無菌操作法解剖取出胚胎。
II、幼鼠胚腎(或肺)取材
幼鼠采用上述方法處死消毒后，腹部朝上固定在木板上，先切開游離毛皮并拉開至兩側：然后采用無菌法打開胸腔取肺，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開游離并拉向兩側，然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。
6、雞(鴨)鳥類胚胎組織取材步驟
1）、取孵化至適當胚齡(9~12天)的胚蛋，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管、胚體有運動的胚蛋，說明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置。
2）、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼，再用75%酒精棉球擦干;
經碘酒、75%酒精消毒后，在無菌條件下采用無菌法用剪刀或鑷子打開氣室，沿氣室邊緣去除蛋殼;
3）、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;
4）、用彎頭鑷輕挑起胚頭，取出胚胎，放入無菌平皿中，解剖取材。
二、原代細胞與細胞系的區(qū)別
三、原代細胞分離培養(yǎng)
取材--分離--培養(yǎng)--鑒定
首先將組織從機體中取出，經胰蛋白酶/膠原酶處理后分散成單細胞，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數后進行細胞鑒定。
四、實驗步驟：
1.取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。
2.在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦。
3.將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。
4.用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。
5.大腦皮質放于DMEM中(含慶大霉素和谷氨酰胺 )，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI)，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。
6.室溫1 000×g離心8min，去上清液。
7.沉淀中加入20％BSA重懸浮，充分混勻，1 000×g，20min，4℃離心，去上清。
8.沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮，混勻，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min，去上清液。
9.沉淀加入2ml DMEM(含慶大霉素和谷氨酰胺)培養(yǎng)液懸浮混勻，鋪于經離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min，4℃)，1000×g，4℃離心10min。
10.靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫)，去上清液。
加入DMEM完全培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml嘌呤霉素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)24h后更換不含嘌呤霉素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。
