蛋白質(zhì)制備過(guò)程中如何保持蛋白活性？

　蛋白質(zhì)的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作。涉及物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)的知識(shí)很廣。高分子蛋白質(zhì)具有一定的立體構(gòu)象，相當(dāng)不穩(wěn)定，極易變性、變構(gòu)，為得到天然狀態(tài)的蛋白質(zhì)，盡量采用溫和的手段，如中性、低溫、避免起泡等，還要注意防腐。

  動(dòng)物材料中的蛋白質(zhì)有些可溶的形式存在于體液（如血漿、消化硫等）中，可以不必經(jīng)過(guò)提取直接進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質(zhì)，只需要適當(dāng)?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質(zhì)，最后剩下的就是不溶性蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)細(xì)胞破碎后，用水、稀鹽酸及緩沖液等適當(dāng)溶劑，將蛋白質(zhì)溶解出來(lái)，再用離心法除去不溶物，即得粗提取液。

  整個(gè)制備過(guò)程一般可分為5 個(gè)階段：①材料的選擇和預(yù)處理，②細(xì)胞的破碎（有時(shí)需進(jìn)行細(xì)胞器的分離），③提取，④純化（包括鹽析，有機(jī)溶劑沉淀，有機(jī)溶劑提取、吸附、層析、超離心及結(jié)晶等），⑤濃縮、干燥及保存。以上5 個(gè)階段不是要求每個(gè)方案都完整地具備，也不是每一階段截然分開(kāi)。

  不論是哪一階段使用哪一種方法，均必須在操作中保持生物大分子結(jié)構(gòu)的完整性。保存活性，防止變性及降解現(xiàn)象的發(fā)生。因空間結(jié)構(gòu)主要依靠氫鍵、鹽鍵和范德華力的存在，遇酸、遇堿、高溫、劇烈的機(jī)械作用及強(qiáng)烈的輻射等均可導(dǎo)致活性喪失。（以上資料來(lái)自中國(guó)生命科學(xué)論壇）

  細(xì)胞破碎方法有多種，比如機(jī)械法（如組織搗碎勻漿機(jī)、玻璃勻漿器）、物理法（反復(fù)凍融法、冷熱交替法、超聲波法、高壓破碎），化學(xué)及生物化學(xué)法（加入有機(jī)溶劑、溶解酶或裂解酶、表面活性劑）等。
   組織搗碎勻漿機(jī)

   玻璃勻漿器

  高壓細(xì)胞破碎法是一種物理破碎方法，避免了化學(xué)法和酶法等導(dǎo)致的化學(xué)物殘留和污染等問(wèn)題。超聲破碎法可能出現(xiàn)的起泡現(xiàn)象在高壓破碎時(shí)是不會(huì)出現(xiàn)的。

  樣品經(jīng)適當(dāng)預(yù)處理，再配合使用低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀，提取到的蛋白質(zhì)活性好。（參考文獻(xiàn)：氯氟氰菊酯對(duì)德國(guó)小蠊保護(hù)酶活性的影響，中國(guó)媒介生物學(xué)及控制雜志，2009，20（4）：303-306）。這是因?yàn)樵诩?xì)胞破碎過(guò)程中，低溫超高壓連續(xù)流細(xì)胞破碎儀提供周密的保護(hù)，最大限度地保持蛋白質(zhì)活性，具體表現(xiàn)在：
① 獨(dú)創(chuàng)的沖洗系統(tǒng)及進(jìn)口鏡面拋光316L不銹鋼管道，防止樣品殘留，保證管道清潔，排除酸堿干擾。 316L不銹鋼管道

② 進(jìn)樣、破碎、出樣全過(guò)程可在4~6℃低溫循環(huán)水浴中進(jìn)行，避免高溫導(dǎo)致的蛋白質(zhì)失活。


③ 破碎壓力0~207Mpa連續(xù)可調(diào)，便于摸索最佳破碎條件，保證溫和破碎。

 高壓表