一種針對細胞表面受體進行抗體篩選的多重分析方法[創(chuàng)新技巧]

    本文以人EGFR抗體與細胞表面EGFR抗原結合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應用。EGFR配體的蛋白家族參與了細胞遷移，粘附和分化等活動，包括乳腺癌，肺癌，結腸癌在內的許多疾病都和EGFR的過度表達有著密切的關系。

    不同靶蛋白的單克隆抗體的應用領域不斷擴大，可以用于不同疾病的治療和診斷（譬如癌癥，自身免疫性疾病）。單克隆抗體是特定細胞系針對特定抗原的分泌到細胞培養(yǎng)基中的生物蛋白，而高通量篩選是抗體開發(fā)的重要組成部分。

ELISA和Mix-and-read

    利用傳統(tǒng)ELISA技術在進行抗體篩選時有許多局限性，由于ELISA技術依賴于微孔板上包被的抗原，所以該方法不適合檢測低溶解性的抗原（譬如細胞表面受體）。由于ELISA的操作方式，使得ELISA很難進行識別細胞表面抗原天然構象的抗體的篩選。即使對于可溶性抗原抗體篩選，由于微孔板對檢測抗體的吸附從而改變蛋白構象，繼而無法識別抗原特定抗原表位。

    一種“mix-and-read”分析方法在生物制藥行業(yè)的單克隆抗體篩選領域得到廣泛應用。這種”mix-and-read”分析方法是將所有分析組分加到一個孔中，繼而孵育從而使得結合達到平衡。對于抗體篩選，該方法可以利用包被抗原的珠子或者表達抗原的細胞進行分析，抗原抗體的相互作用可以通過結合在珠子或者細胞的熒光標記的偶聯物的熒光強度進行檢測。結合的熒光可以利用細胞技術儀無需洗滌進行分析，以達到區(qū)分測試孔中結合和游離的熒光。Lee等在發(fā)明FMAT時，詳細介紹了相比傳統(tǒng)ELISA方法細胞計數儀的優(yōu)勢。相對于傳統(tǒng)的ELISA分析方法，利用該技術分析“mix-and-read”實驗可以提高檢測的靈敏度和分析的通量，同時也提高抗體的識別和檢測。

高速的多重分析

    TTP LabTech的mirrorball非常適合這種“mix-and-read”實驗的分析，由于其靈敏度很高，從而可以檢測低豐度表達的細胞膜蛋白。該儀器不僅能夠快速進行單激光掃描，而且可以同時進行405,488,640nm激光掃描，因此可以進行多種熒光素的選擇。其可以不依賴于激發(fā)光直接對發(fā)射熒光進行矯正的能力，從而在抗體篩選應用中可以對珠子和細胞進行多重分析。

    該文章中以人EGFR抗體與細胞表面EGFR抗原結合為例，描述TTP Labtech的mirrorball儀器作為一種“mix-and-read”方法在在抗體篩選中的應用。EGFR配體的蛋白家族參與了細胞遷移，粘附和分化等活動，包括乳腺癌，肺癌，結腸癌在內的許多疾病都和EGFR的過度表達有著密切的關系，因此抑制EGFR的表達和激活在治療這些疾病過程中起著非常重要的作用。

    為了檢測mirrorball的檢測敏感性，該通訊利用兩種高表達EGFR的上皮癌細胞系A549和A431進行檢測不同濃度的抗EGFR受體與EGFR的結合能力的分析。傳統(tǒng)篩選方法是采用表達和不表達抗原的細胞分別進行抗體的結合能力以達到篩選抗原特異性的抗體，譬如利用轉染目的基因的細胞和未進行轉染的宿主細胞進行反篩選。如果利用已有的篩選平臺（例如： ELISA和FMAT），需要進行制備兩種板以比較抗體對這兩種細胞的結合能力，從而確定抗原特異性的結合能力。

    在該實驗中，mirrorball可以在一個細胞微孔板中對多種細胞進行抗體結合能力的測定，以區(qū)分抗體對不同細胞的特異性結合。mirrorball的這種多元化分析能力在大大降低實驗的成本的同時，可以提高篩選的通量，排除微孔板之間的差異。

實驗方法

細胞系和細胞培養(yǎng)

    該文章對表達EGFR受體的的A549和A431兩種細胞進行了比較，A549，A431和Jurkat細胞購自Sigma。三種細胞的培養(yǎng)條件如下，A549細胞：含有10%FBS的DMEM，2mM L-glutamine和100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；A431細胞：含有10%FBS的EBSS（Sigma），2mM glutamine，1×Non-essential Amino Acids(NEAA)(Sigma), 100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素；Jurkat細胞：RMPI-1640（Sigma），10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml鏈霉素。A431和A549細胞培養(yǎng)到80%的密度時，利用0.25%胰酶和EDTA進行消化，洗滌，重懸到新的培養(yǎng)基中。未有標注的培養(yǎng)試劑均來自于Life Technologies。

抗體和試劑

    鼠抗人EGFR抗體購自Merck Chemical公司（#GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor 647檢測標志物（#A21235）來自于Life Technolgy。

CSFE和BiO標記

    將5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester CFSE（sigma）溶解到DMSO中，使得CSFE濃度為100mM。將10nM CSFE加入細胞中，在室溫條件下孵育10分鐘，接著加入4%PBS（2ml）終止孵育，在37℃孵育10分鐘。將細胞進行洗滌，在1000×g轉速下離心5分鐘。對于細胞計數分析，30nM的DiO（Life Technology）加入分析的混合物中，進行孵育過夜。將細胞進行標記后，在488nm的激光下激發(fā)，在FL-1通道中檢測細胞的熒光信號。

EGFR實驗設計   

    將抗EGFR抗體在細胞培養(yǎng)液中進行梯度稀釋，將稀釋后的不同濃度抗體20ul加入384孔微孔板中（Costar 3712）。制備含有1.25×105 細胞/毫升的懸浮細胞（A431或者A549）和6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647標記物的混合物。將20ul細胞混懸液分別加入含有抗體的微孔板中，然后將微孔板在37℃孵育過夜。在mirrorball對微孔板進行檢測從而確定結合到細胞上的抗EGFR的量。

細胞多重分析實驗   

    將20ul稀釋后的不同濃度的抗EGFR抗體加入384微孔板中。制備含有相同細胞數的EGFR+A549和CSFE標記的EGFR- Jurkat細胞混懸液（總細胞1.25×105 細胞/毫升，6nM 抗鼠IgG AlexaFluor 647標記物）。該實驗是將20ul的細胞混懸液加入含有20ul的抗EGFR抗體的微孔板中（反應孔中的細胞數為2.5×103 細胞和3nM檢測標記物）。將微孔板在37℃中孵育過夜后， 放入mirrorball中利用488nm和640nm激光同時掃描檢測CSFE染料和結合的抗體的熒光強度。

mirrorball數據收集和掃描

   樣品利用mirrorball上的488nm和640nm的激光進行掃描。每個孔的物體可以利用TTP Labtech專利的閾值運算進行在位分析，同時可以提供形態(tài)和熒光參數。數據可以mirrorball特有的Cellista 軟件通過多種方式進行顯示，包括柱狀圖，散點圖，3D熒光強度分布圖，整個孔的圖片。

結果

EGFR的Mix-and-read 分析的檢測靈敏度

    在該研究中，為了在細胞水平結合實驗中評估檢測的靈敏度，A431和A549細胞，不同濃度的EGFR抗體和Alexa Fluor 647標記的山羊抗鼠IgG共同孵育過夜。圖1表明在A431細胞上EGFR抗體的檢測濃度為5ng/ml，而在A549細胞上其檢測限為5-10ng/ml。這表明EGFR在A549細胞上的表達水平比A431細胞表達水平低。   

    該結果表明利用mirrorball檢測抗EGFR抗體的水平和已經退出市場的FMAT的檢測結果是一致的。兩種檢測方法在抗體濃度高于100ng/ml 時均出現總熒光強度降低的現象，該現象的產生是由于文獻所說的“鉤子效應”。由于一抗的過量存在，從而使得結合在檢測抗體的熒光無法讀取。

圖1. A431/A549上的總熒光強度隨抗EGFR抗體濃度增加而加強。

多激光掃描

    mirrorball的三激光使得用戶可以利用多種熒光標記的標志物進行細胞計數分析。在該研究中，A549細胞被DiO標記（488nm激光激發(fā)），同時利用EGFR抗體和AlexaFluor 647標記物進行多重分析。經過過夜的孵育，利用488nm和640nm雙重激光進行細胞數和EGFR標記分析。圖2表明在細胞數目恒定的情況下，，細胞的總熒光強度隨著EGFR抗體濃度的增加而加強。非常重要的一個特征，細胞數目可以在沒有EGFR抗體結合的情況下得到。

圖2：A549細胞總熒光強度隨著EGFR濃度增加而加強，細胞計數可單獨讀取。

細胞的多重分析

    mirrorball所獨有的多種激光同時掃描特征可以在轉染和宿主混合細胞中區(qū)分出抗原表達和未表達的細胞群體。為了闡明該方面的特性，在A549（EGFR+）和CSFE標記的Jurkat （EGFR-）進行EGFR抗體的結合篩選實驗。在分析之前，將Jurkat細胞進行CSFE（10nM）的染色。圖3顯示了A549和Jurkat細胞在100ng/ml抗體的結合條件下的3D熒光強度圖譜，可以看到EGFR抗體特異性結合到A549細胞，在Jurkat細胞未檢測EGFR抗體的結合。

圖3： 細胞計數的三維分析。在混合細胞中，mirrorball利用多重激光掃描，可以同時檢測A549和Jurkat細胞的熒光信號。

    圖4顯示利用A549單一細胞和A549，Jurkat混合細胞進行EGFR抗體結合實驗，其檢測靈敏度的沒有明顯的差異。

圖4：利用單一A549細胞和Jurkat，A549細胞進行EGFR結合實驗的比較。利用單一細胞群體和混合細胞對結合實驗沒有明顯的差異。

討論

    TTP Labtech公司的mirrorball微孔板計數儀為細胞表面抗原抗體的篩選試驗提供一種穩(wěn)健，即混即讀的方法。該儀器非常適合抗體的研發(fā)，其獨有的光學元件和軟件設計使得該儀器具有極高檢測靈敏度，足夠檢測低豐度的蛋白的結合實驗。

    該文章表明EGFR實驗設計非常簡單，經過簡單的修改即可在mirrorball上進行分析。這種“Mix-and-read”分析方法與傳統(tǒng)的ELISA步驟比較可以免去洗滌，孵育步驟，從而大大節(jié)省篩選所需要的時間。 同時，該實驗采用較少的樣品和試劑消耗使得實驗的花費大大節(jié)省。

    mirrorball是提供多激光同時掃描的第一代分析系統(tǒng)，可以對熒光進行激光之間的矯正。與合適的熒光試劑結合使用，這種多激光的同時掃描的能力可以進行獨立的細胞識別和多參數分析，提供篩選的通量，大大降低實驗的成本，使得實驗操作非常的便利。在該文章中，采用DiO的反染，細胞數目可以不依賴于抗體的結合而直接進行測定，這樣可以排除由于細胞接種的不同或者細胞毒性引起的假陽性。

    另外，mirrorball擁有在同一個孔中能夠區(qū)分出宿主細胞和轉染了特定基因細胞的能力，該能力可以極大的加速抗體篩選的進程。mirrorball還擁有在同一孔對A431和Jurkat細胞進行同時檢測的能力。 細胞的多重分析擁有很多優(yōu)勢，譬如可以排除不同細胞之間的板間差異，篩選通量增加一倍，減少樣品的使用量。

參考文獻
1. Lee, R., Tran, M., Nocerini, M. and Liang, M. (2008) A High-Throughput Hybridoma Selcetion Methods Using Fluorometric Microvolume Assay technology. J. Biomol. Screening 13: pp210-17.
2. Bowen, W. and Wiley, P. (2006) Application of Laser-Scanning Fluorescence Microplate Cytometry in High Content Screening. Assay and Drug Development Technologies. 4: pp209-2

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