【SCI 22分客戶成果】circRNA抑制由DNA感受器cGAS介導的長期造血干細胞耗竭

      中科院生物物理研究所的范祖森教授課題組主要從事腫瘤干細胞、免疫細胞發(fā)育分化及腫瘤靶標發(fā)現(xiàn)與腫瘤個體化治療等領域的研究，近期其團隊利用Arraystar Mouse CircRNA Array研究了小鼠骨髓細胞（BM）中分離的長期造血干細胞（LT-HSCs）和多能干細胞（MPPs）的circRNAs表達譜。研究篩選出一個在LT-HSCs細胞核高表達的circRNA cia-cGAS，通過一系列功能機制實驗發(fā)現(xiàn)LT-HSCs中cia-cGAS可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS相互結合并抑制了其酶活性，阻礙cGAS結合基因組DNA，從而不能激活I型干擾素（IFN）的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)。該研究同時也發(fā)現(xiàn)cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫相關的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發(fā)靶標。研究成果2018年發(fā)表在國際知名學術期刊Immunity（IF=22.845）。（芯片實驗由康成提供技術服務） 

研究背景
 

       長期造血干細胞作為潛能最高的干細胞系，具有最高的更新和分化能力，可以為短期造血干細胞、多能干細胞等提供了持續(xù)性細胞補給。大多數(shù)時候，LT-HSCs處于休眠的靜息狀態(tài)，其干性的維持受轉(zhuǎn)錄因子及骨髓內(nèi)環(huán)境等多種因素的影響，比如TNF、CXCL4和I型IFN等，然而LT-HSCs在靜息狀態(tài)與激活狀態(tài)之間的精細調(diào)控機制尚未完全解析。

       cGAS作為胞質(zhì)DNA感受器已被廣泛研究。在結合DNA時，cGAS會催化cGAMP的生成，cGAMP能結合干擾素刺激因子并誘導cGAS-STING信號通路的激活，從而上調(diào)I型IFN的表達和一系列免疫反應。cGAS不僅可以識別病原性DNA，還可識別機體自身DNA。在造血干細胞中，細胞核內(nèi)的cGAS是如何避免與自身DNA結合并防止自身免疫反應和機體損傷，仍少見研究報道。

       CircRNAs是一大類具有閉合環(huán)狀結構的非編碼RNA分子，通過多種機制發(fā)揮調(diào)控作用，然而關于circRNAs在LT-HSCs靜息狀態(tài)調(diào)控方面研究仍然比較少。本研究的目的就是通過circRNA芯片篩選驗證調(diào)控LT-HSCc靜息狀態(tài)的circRNAs，并通過一系列功能機制實驗研究該調(diào)控的作用機制，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供新思路和潛在藥物研發(fā)靶標。

研究思路
 

       首先作者通過Arraystar Mouse CircRNA芯片分析了小鼠骨髓中分離的LT-HSC與MPPs的circRNAs表達譜，篩選出156種差異表達的circRNAs， qPCR驗證結果與芯片一致。shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)，只有D430042O09Rik基因轉(zhuǎn)錄的circRNA cia-cGAS可以影響LT-HSCc的亞群分布。隨后作者通過qPCR、Northern blot、核質(zhì)分離及原位雜交實驗發(fā)現(xiàn)cia-cGAS在LT-HSCs的細胞核內(nèi)高度表達。

       接下來作者對cia-cGAS的相關功能進行了研究。作者通過刪除下游的反向互補序列特異性敲除cia-cGAS，F(xiàn)ACS分析表明敲除后LSK細胞明顯增多，LT-HSC明顯減少，并且敲除后LT-HSCs的BrdU染色陽性率明顯高于對照組，表明敲除后LT-HSCs處于活躍的增殖階段。脈沖標記也顯示敲除后LT-HSCs細胞靜息狀態(tài)的比例顯著降低。然后作者通過對敲除小鼠的mRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)I型IFN表達顯著上調(diào)，qPCR和ELISA也驗證了這一結果。以上實驗表明cia-cGAS可以通過I型IFN信號傳導調(diào)控LT-HSCs的靜息狀態(tài)。

       最后作者對cia-cGAS發(fā)揮功能的分子機制進行了探討。RNA pull down、RIP、免疫熒光、EMSA和FISH實驗發(fā)現(xiàn)cia-cGAS可以和cGAS蛋白相互作用。接下來作者通過酶活測定、ChIP、HPLC、熒光素酶和質(zhì)譜實驗表明cia-cGAS可以阻礙cGAS與LT-HSCs自身DNA結合，從而抑制其酶活性，不能激活I型IFN的表達。然后作者用CRISPR/Cas9突變cGAS基因，qPCR、ELISA、BrdU標記等實驗表明，突變后I型IFN表達被抑制，LT-HSCs細胞數(shù)量正常且更多的維持在靜息狀態(tài)。這些均表明了cia-cGAS作用的機制就是通過結合cGAS抑制其表達，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSC的靜息狀態(tài)。動物實驗顯示，在cia-cGAS敲除的小鼠中，poly（I:C）與HSV病毒的刺激均可導致大量I型干擾素的產(chǎn)生，從而誘發(fā)自身免疫性疾病，而cia-cGAS過表達則可以消除這些，表明cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫疾病的有效抑制劑。


技術路線

結果展示

圖1 Arraystar mouse circRNA芯片篩選和qPCR驗證結果及cia-cGAS表達分析結果，cia-cGAS在LT-HSCs細胞核中高表達

圖3 cia-cGAS機制研究結果，cia-cGAS結合cGAS抑制其表達，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)，cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫疾病的有效抑制劑
 

研究意義

       本研究通過Arraystar Mouse CircRNA Array篩選出一個LT-HSCs細胞核高表達的circRNA cia-cGAS，功能機制實驗發(fā)現(xiàn)LT-HSCs中cia-cGAS可以與DNA敏感的cGAMP合酶cGAS結合抑制其酶活性，阻礙cGAS結合基因組DNA，從而不能激活I型IFN的表達，維持LT-HSCs的靜息狀態(tài)。同時cia-cGAS是cGAS介導的自身免疫相關的有效抑制劑，為有效防治自身免疫性疾病與血液系統(tǒng)惡性腫瘤提供了新思路和潛在藥物研發(fā)靶標。

原文出處
A Circular RNA Protects Dormant Hematopoietic Stem Cells from DNA Sensor cGAS-Mediated Exhaustion. Immunity，2018.