活體多光譜熒光成像應用實例

傳統(tǒng)的活體光學熒光成像（FLI）采用一個激發(fā)濾光片和一個發(fā)射濾光片。這對于區(qū)分靶向信號、可能存在的報告基因信號以及自體熒光組織信號而言有著諸多局限。多光譜（MS）FLI 采用多個激發(fā)濾光片和單個發(fā)射濾光片，或單個激發(fā)濾光片搭配多個發(fā)射濾光片，可以產(chǎn)生獨特的熒光區(qū)域或材料的光譜曲線。（1）因此，圖像上每一個像素點的熒光組分可以由此來確認（圖 1）。

選擇活體MS FLI 有兩大原因：

1-在組織自體熒光的特定范圍內(nèi)對波長較短的報告基因進行成像時，可以抑制自體熒光背景信號。

2-在利用帶有重疊譜的波長較長的報告基因（如 NIR）進行成像

時，可以抑制交叉反應對獨特的報告基因?qū)崿F(xiàn)清晰的檢測。

為了了解這兩大原因，首先有必要了解小鼠組織自體熒光的基礎(chǔ)知識，及其在熒光光譜不同范圍中的成像。下圖 2 顯示了在采用綠/紅、藍/綠濾光片和 NIR 濾光片組合（2）時小鼠組織典型的天然自體熒光特性。值得注意的是綠/紅和藍/綠濾光片表現(xiàn)出較高的組織自體熒光水平，但 NIR 濾光片成像表現(xiàn)出的組織自體熒光相對較少。在使用綠色熒光蛋白（GFP）、紅色熒光蛋白（RFP）等報告基因、異硫氰酸熒光素（FITC）和 Alexa 600 時應用MSFLI可以有效地減少組織自體熒光。而遠紅（650-700 nm）或近紅外（NIR; 700-900 nm）熒光團作為替代方案，因為在此光譜范圍內(nèi)皮膚自發(fā)熒光作用較小，但需要多重濾光片（3）。這種方法可以同時檢測多個分子標志物，例如 熒光細胞示蹤報告探針和 熒光 蛋白酶活力報告探針等。此外，鼠類食物經(jīng)常包含含葉綠素的植物材料，可能在低 NIR 光譜中產(chǎn)生強烈的自體熒光。多光譜成像常常用于抑制這種胃腸道（GI）自體熒光，避免因成像研究而將飼料更換為無紫苜蓿的鼠類飼料。

布魯克系統(tǒng)采用“基于激發(fā)”的多光譜成像方式。其中，多個激發(fā)濾光片和單個發(fā)射濾光片被用來捕獲“疊合圖像”。對于包括基因熒光蛋白報告在內(nèi)的大多數(shù)有機熒光團而言，激發(fā)光譜可以比發(fā)射光譜（圖 3）提供更多的信息，而與基于發(fā)射的多光譜成像相比，基于激發(fā)的多光譜成像能夠更好地捕獲這些不同的信息。

系統(tǒng)共配置 28 個激發(fā)濾光片。在定義發(fā)射濾光片前，應該為給定的成像實驗選擇最佳激發(fā)濾光片。而為了更好地選擇濾光片，事先比對用于成像的報告基因的激發(fā)光譜曲線的熒光光譜差異是非常有用的。在下方（圖 4）Alexa 680 和 Alexa 700 的例子中，二者在 520 和 720 nm 之間的激發(fā)光譜存在明顯差異。（了解 Alexa 680 和Alexa 700 濾光片選擇和建模的完整內(nèi)容，請查看網(wǎng)絡(luò)研討會： https://youtu.be/iEyLl3qAzpA)。

系統(tǒng)配置 6 個發(fā)射濾光片（535 nm、600 nm、700 nm、750 nm、790 nm 和 830 nm）。通常選擇在波長最長的激發(fā)濾光片60 nm 內(nèi)不重疊的發(fā)射濾光片。所選發(fā)射濾光片無需與熒光發(fā)射的峰值一致，濾光片應優(yōu)先選擇覆蓋特異熒光光譜的激發(fā)濾光片。繼續(xù)以 Alexa 680 和 700 成像為例，由于 535、600、700 和 750 nm 濾光片帶寬范圍與選定的激發(fā)濾光片范圍（圖 5）重疊，因此這里可以選擇 790 nm 的濾光片。

在“捕獲（Capture）”對話框中（圖 6）中支持選擇多個激發(fā)濾光片用于采集編程。應該把多光譜采集作為之后多光譜建模和/或分離實驗方法的一部分進行。

啟始成像和研究設(shè)置包括用于優(yōu)化設(shè)置和建模的初始步驟：

1- 熒光團成像（體外）

2- 生成光譜模型

3- 體內(nèi)模型評估

首先，我們建議您使用上文確定的濾光片對稀釋后的熒光團進行成像。一旦采集到圖像，通過將高斯曲線擬合到熒光團的實驗曲線來創(chuàng)建光譜曲線（圖7）。

一旦光譜曲線實現(xiàn)了優(yōu)化，模型就可以直接被調(diào)用到之后的數(shù)據(jù)集里，無需修改。如需將現(xiàn)有模型應用到新的數(shù)據(jù)集中，則選擇“分離圖像”面板中的“+”，選擇所需模型和“分離（Unmix）”按鈕（見圖 8）。系統(tǒng)采用適合求解多光譜模型的最小二乘法，將模型分配給各個像素（4）。為此，每個像素中的光譜總和需要與參考圖譜庫中的所有可能的組合總和相匹配。分離算法還添加了一些額外的限制（如非負性）。因此，成功進行光譜分離的關(guān)鍵就在于獲取圖譜庫熒光團的準確光譜。一旦確定各個熒光團中的光譜作用，所采集的疊合圖像就可以被分離成各個熒光團的獨立圖像。

每個“分離”圖像都由來自單獨“通道”的重疊圖像組成（以上述 Alexa 680 和 Alexa 700 為例）。各個圖像都可以在布魯克MI軟件中打開，并使用感興趣區(qū)（ROI）應用的相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析，例如，平均值、總和和凈光強度、面積和周長以及自動ROI查找功能和圖像數(shù)學。換句話說，相機測量的強度可能與動物體內(nèi)發(fā)光物質(zhì)釋放的“真實”信號強度以復雜方式有相關(guān)性。傳感器捕捉到信號之后，接下來的多光譜分析可以定量產(chǎn)生準確的成分特定數(shù)據(jù)（1）.

使用綠色或紅色基因熒光報告或乃至多個 NIR 熒光團的研究可以受益于熒光光譜建模。使用多光譜成像可以識別和建模報告基因的不同光譜曲線，從而減少自體熒光。圖 9 和 10 顯示了采用多光譜方法扣除組織自體熒光的感染利什曼原蟲的兔足墊模型成像（M. Leevy，美國圣母大學，未出版）。

在另一個例子中，多光譜成像被用于一項體內(nèi)聚合物粒子示蹤研究（5）。注射 4 小時后，在肝臟區(qū)域（圖 11）檢測到標記為Cy7 的顆粒，在 GI 區(qū)域獲得的可能由食物葉綠素產(chǎn)生的串擾信號被分離，提供了顆粒信號的清晰定位。

在一項納米顆粒/腫瘤研究中，在同一腫瘤小鼠中檢測到了不同大小的納米顆粒生物分布（6）。納米顆粒被差異標記，多光譜成像也用于分離循環(huán)納米顆粒的信號（圖 12）。

釋放體內(nèi)熒光成像的所有潛能

總結(jié)

活體多光譜熒光成像可以扣除組織自體熒光和進行多種熒光團成像。這可以增強信噪比并進行先進的多重熒光成像，實現(xiàn)更強大的研究設(shè)計。

參考文獻

[1] Levenson RM, Lynch DT, Kobayashi H, Backer JM, Backer MV (2008). Multiplexing with multispectral imaging: from mice to microscopy. ILAR J 49-78.

[2] Frangioni, JV (2003). In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr Opin Chem Biol.;7:626-34.

[3] Weissleder R, Ntziachristos V (2003). Shedding light onto live molecular targets. Nat Med. 9( 1 ) 123-8.

[4] Farkas DL, Du C, Fisher GW, Lau C, Niu W, Wachman ES, Levenson RM (1998). Non-invasive image acquisition and advanced processing in optical bioimaging. Comput Med Imaging Graph. 22(2):89-102.

[5] Alexander L, Dhaliwal K, Simpson J, Bradley M. (2008) Dunking doughnuts into cells--selective cellular

translocation and in vivo analysis of polymeric micro-doughnuts. Chem Commun (Camb). 14;( 30 ):3507-9

[6] Chou LY, Chan WC (2012). Fluorescence-tagged gold nanoparticles for rapidly characterizing the size-dependent biodistribution in tumor models. Unpublished.