【干貨】活體成像-讓腫瘤細(xì)胞無處遁形

瀏覽次數(shù)：4255　發(fā)布日期：2018-12-5　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

在科普今天的知識前，不禁讓小編回憶起大學(xué)校園的美好時(shí)光，那個(gè)時(shí)候小編還是個(gè)走在綠樹蔭下的青澀少年啊，在一次參加關(guān)于腫瘤免疫學(xué)的學(xué)術(shù)會議上，看到了類似下面這種圖，我就在想，這小鼠是修煉了什么內(nèi)家功法，被打通任督二脈了？那五顏六色的東東是什么？經(jīng)過向老師還有身邊的小伙伴們請教才知道，這是利用活體成像技術(shù)做到的哇！當(dāng)時(shí)覺著這東西好高大上啊，小編真是孤落寡聞了，實(shí)在慚愧！小編后來對這個(gè)技術(shù)進(jìn)行了一番考究，下面就給大家說道說道。

圖1.活體成像^[1]

早在1999年由美國哈佛大學(xué)Weissleder博士（圖2）率先提出了分子影像學(xué)(molecular imaging，MI)的概念，即應(yīng)用影像學(xué)的方法對活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。活體成像便是基于分子影像學(xué)孕育而生的，通過這個(gè)成像系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，感染性疾病的發(fā)展進(jìn)程，特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。

圖2. Ralph Weissleder^[2]

近年來，我國醫(yī)療健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展突飛猛進(jìn)，新藥研發(fā)逐漸成為科研機(jī)構(gòu)和醫(yī)藥公司重點(diǎn)研究領(lǐng)域，其中活體成像為藥物研發(fā)貢獻(xiàn)了一份十分寶貴的力量。目前，小動物活體成像技術(shù)應(yīng)用到藥物研發(fā)的實(shí)驗(yàn)方法主要有生物發(fā)光和熒光兩種。

基于生物發(fā)光的活體成像技術(shù)方法與應(yīng)用

生物發(fā)光主要是應(yīng)用熒光素酶（Luciferase）對基因、細(xì)胞和活體動物進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù)，將熒光素酶的基因插入到預(yù)期觀察的細(xì)胞染色體內(nèi)，通過對克隆細(xì)胞進(jìn)行篩選，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。再將細(xì)胞株轉(zhuǎn)移至特定的小鼠體內(nèi)形成模型。向模式小鼠注射一次熒光素（熒光素酶的底物）能保持其體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光持續(xù)30-45分鐘。因?yàn)槊看螣晒馑孛复呋磻?yīng)只能產(chǎn)生一個(gè)光子，這是肉眼無法觀察到的，因此需要先進(jìn)的成像系統(tǒng)，再應(yīng)用一個(gè)高度靈敏的制冷CCD相機(jī)以及特別設(shè)計(jì)的成像暗箱和成像軟件，才可觀測并記錄到這些光子（圖3）。^[1,3,4]

簡單來說，熒光素酶與底物反應(yīng)后，會產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。這種光是由化學(xué)反應(yīng)而來，不需要激發(fā)光。儀器記錄的是單位時(shí)間內(nèi)檢測到的光子數(shù)，也就相當(dāng)于直接定量的記錄了表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞數(shù)量。

圖3. 應(yīng)用制冷CCD相機(jī)捕捉光源

下面隨小編一起來看一組活體成像技術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤血液系統(tǒng)疾病上的應(yīng)用示例：Myc 基因是細(xì)胞增殖的主要調(diào)節(jié)因子，而且對于癌癥腫瘤細(xì)胞分裂，新陳代謝和存活都有重要作用。JQ1是用來抑制BET溴區(qū)結(jié)構(gòu)域的小分子，而且可以下調(diào)Myc基因轉(zhuǎn)錄水平。將JQ1腹腔注射到荷多發(fā)性骨髓瘤（經(jīng)Luciferase標(biāo)記）小鼠中，活體成像系統(tǒng)顯示JQ1可以抑制骨髓腫瘤細(xì)胞生長且提高腫瘤小鼠的存活率（圖3A-B）。結(jié)果說明應(yīng)用JQ1 能夠緩解骨髓瘤癌癥癥狀(腫瘤發(fā)展與熒光強(qiáng)度線性相關(guān))。^[5]

圖4.小鼠靜脈注射Luciferase標(biāo)記多發(fā)性骨髓瘤的活體成像圖^[5]

基于熒光的活體成像技術(shù)方法與應(yīng)用

與生物發(fā)光不同，熒光技術(shù)是采用熒光報(bào)告基因 (GFP、RFP等) 或熒光染料（包括熒光量子點(diǎn)等新型納米標(biāo)記材料）進(jìn)行標(biāo)記，利用報(bào)告基因、熒光蛋白質(zhì)或染料產(chǎn)生的熒光，就可以形成體內(nèi)的生物光源。生物發(fā)光是動物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而熒光則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)，才可以被成像系統(tǒng)檢測到。熒光標(biāo)記很廣泛，可以是動物、細(xì)胞、微生物，也可以是抗體、藥物、納米材料等^[1,3,4]。

接下來小編帶大家再看一組應(yīng)用熒光技術(shù)的實(shí)驗(yàn)：為研究模式蛋白的腫瘤靶向性，將一種近紅外熒光分子吲哚菁綠（ICG）包載PDPA（人血清白蛋白表面定點(diǎn)原位生長出具有pH響應(yīng)性的高分子鏈）制成納米熒光探針（HDI），ICG包載在膠束核內(nèi)而發(fā)生熒光聚集淬滅，但到達(dá)腫瘤時(shí)，由于腫瘤微環(huán)境的弱酸性，膠束解體，ICG釋放出來而恢復(fù)熒光，同時(shí)由于PDPA質(zhì)子化帶正電，有利于其吸附在細(xì)胞表面以及細(xì)胞內(nèi)吞，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向熒光成像。本項(xiàng)研究也表明，在蛋白表面引入pH響應(yīng)性高分子鏈可提高蛋白靶向性，藥用蛋白可采用此項(xiàng)技術(shù)提高藥效且降低副作用，同時(shí)該響應(yīng)性蛋白質(zhì)-高分子偶聯(lián)物自組裝體系也可作為小分子藥物載體，從而拓展了蛋白藥物和小分子藥物的臨床應(yīng)用^[6]。（圖5）

圖5. 小鼠靜脈注射HDI納米熒光探針后C8161黑色素瘤在體內(nèi)和體外熒光成像圖^[6]

雖然熒光信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。兩者具體優(yōu)缺點(diǎn)詳見表（一），對于不同的研究，可根據(jù)二者的特點(diǎn)以及實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的方法哦^[7]。

表（一）

當(dāng)然，除了上述兩個(gè)方法外，也有通過Luciferase標(biāo)記腫瘤，再用熒光探針標(biāo)記抗體進(jìn)行研究的。如圖6所示，應(yīng)用BLT（生物發(fā)光成像）對穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的小鼠乳腺腫瘤4T1進(jìn)行定位（圖6A），再對小鼠尾靜脈注射熒光探針（IRDye800CW）標(biāo)記的PD-1抗體，經(jīng)FMI（熒光成像）檢測PD-1-IRDye800CW生物分布（圖6B）。^[8] 通過這種方式，我們可以一邊觀察腫瘤細(xì)胞在哪里，一方面觀察抗體藥分布情況，看上去就更高端了，有沒有？

圖6. FMI檢測荷4T1-Luc乳腺腫瘤小鼠的PD-1-IRDye800CW生物分布^[8]

重點(diǎn)來啦，百奧賽圖目前擁有自主開發(fā)的B-IL17-EGFP敲入小鼠，該小鼠模型所有表達(dá)IL17的組織細(xì)胞同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)，用以研究與細(xì)胞因子IL-17相關(guān)的一系列慢性疾病^[9]。藥理藥效平臺擁有多種GFP-Luciferase細(xì)胞系及腫瘤模型，可以進(jìn)行皮下及原位腫瘤模型建立或轉(zhuǎn)移瘤模型建立，開展針對相應(yīng)模型的體內(nèi)藥理藥效服務(wù)^[10]。基因編輯平臺可根據(jù)客戶需求提供多種報(bào)告基因（如EGFP、mRFP、mCherry、mYFP或LacZ等）小鼠(目的基因的位置引入報(bào)告基因)，方便研究目的基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，監(jiān)控目的蛋白表達(dá)定位及細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)等^[11]。如有需要，歡迎小伙伴們詳細(xì)咨詢哦！

參考文獻(xiàn)

[1] Stout D, David J. Optical Bioluminescence Protocol for Imaging Mice. Methods Mol Biol. 2018;1790:29-40.

[2] https://en.wikipedia.org/wiki/Ralph_Weissleder

[3]王紅建，熊曉鵬，戴云海等。活體生物發(fā)光成像技術(shù)及其在消化道研究領(lǐng)域中的應(yīng)用. 胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志。2010

[4]李冬梅，萬春麗，李繼承。小動物活體成像技術(shù)研究進(jìn)展.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)。2009

[5] Delmore JE,et al. BET bromodomain inhibition as a therapeutic strategy to target c-Myc. Cell. 2011 Sep 16;146(6):904-17.

[6]LiP, SunM, XuZ, LiuX, ZhaoW, GaoW.Site-Selective in Situ Growth-Induced Self-Assembly of Protein-Polymer Conjugates into pH-Responsive Micelles for TumorMicroenvironment Triggered Fluorescence Imaging. Biomacromolecules. 2018 Nov 12;19(11):4472-4479.

[7]https://baike.baidu.com/item/可見光活體成像技術(shù)

[8]Yang Du,et al. Improved resection and prolonged overall survival with PD-1-IRDye800CW fluorescence probe-guided surgery and PD-1 adjuvant immunotherapy in 4T1 mouse model.Int J Nanomedicine. 2017; 12: 8337–8351.

[9]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/103.html

[10]http://www.bbctg.com.cn/index/article/index/aid/13.html

[11]http://www.bbctg.com.cn/index/index/geneinfo/id/46/cateid/65/cid/12.html