冷凍電鏡樣本制備新技術在新冠病毒結構解析的應用

前言

近日，由新型冠狀病毒引起的肺炎疾病在武漢和全國各地都形成了一定規(guī)模的爆發(fā)，已經(jīng)引起了中國甚至全球的高度重視，那么這個冠狀病毒究竟是什么？

冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬冠狀病毒科(Coronaviridae)，是具外套膜(envelope) 的正鏈單股RNA病毒，直徑約80～120nm。冠狀病毒可以引起中東呼吸綜合征、嚴重急性呼吸綜合征以及目前正在爆發(fā)的新型肺炎。近日，國家病原微生物資源庫發(fā)布了由中國疾控制中心病毒預防控制所成功分離的我國第一株病毒的電鏡照片。 

下圖中（電子顯微鏡下的新型冠狀病毒武漢株01），黑色箭頭所示就是新型冠狀病毒，可以看出，病毒的大小約為100納米。

 

解析冠狀病毒結構，助力疫苗和藥物研發(fā)

目前，我們已知新型冠狀病毒是RNA病毒，它的蛋白結構序列還沒有確定出來，在分離完毒株之后，則要用冷凍電鏡來全面解析病毒的三維結構，從而為開發(fā)疫苗和相關的藥物奠定基礎。2019年，中國科學家利用冷凍電鏡技術解析到世界上目前分辨率最高的豬瘟病毒結構，這對我們了解該病毒的發(fā)病機理，以及如何更好地開發(fā)疫苗至關重要。在這個特殊的時期，盡快加速新冠病毒的結構解析同樣意義重大，有助于研發(fā)出更多更好的抗新型肺炎藥物。

我國科學家解析出的非洲豬瘟病毒結構示意圖

最近，上�？萍即髮W和中科院上海藥物所聯(lián)合團隊預先公布抗冠狀病毒最關鍵的蛋白之一，3CL水解酶的高分辨率晶體結構，并已迅速發(fā)現(xiàn)了30種可能對新型冠狀病毒有治療作用的藥物、活性天然產(chǎn)物和中藥。在這個過程中，冷凍電鏡技術是獲得高分辨率的冠狀病毒三維結構的最佳手段。那么，冷凍電鏡是何物？

冷凍電鏡技術： 結構生物學的革命性突破
 

冷凍電鏡技術（Cryo-EM）的基本原理是將生物大分子溶液置于電鏡載網(wǎng)上形成一層非常薄的水膜，然后利用快速冷凍技術如置于液態(tài)乙烷使其形成玻璃態(tài)的冰，生物大分子就被固定在這層薄冰里。將這樣的冷凍樣品保持低溫放置在透射電子顯微鏡下觀察，從而獲得生物大分子原子分辨率的三維空間結構，被稱為冷凍電鏡技術。冷凍電鏡的出現(xiàn)，突破了傳統(tǒng)方法如X射線晶體衍射和核磁共振的技術局限，使得解析高分辨率生物大分子復合物的三維結構變得更為容易和常規(guī)。
 

英國劍橋MRC實驗室人員在操作冷凍電鏡
 

近年來，越來越多蛋白質或復合蛋白質結構解析領域被稱為諾貝爾獎級別的論文陸續(xù)發(fā)表，背后的利器正是冷凍電鏡。2015年，《自然》雜質旗下的子刊nature method將冷凍電鏡技術評為年度最受關注技術。在過去幾年里，冷凍電子顯微鏡技術逐漸成為結構生物學的重要研究工具。冷凍電鏡技術的三位先驅者，也憑借對冷凍電鏡技術的開拓和持續(xù)推進，獲得了2017年的諾貝爾化學獎，以表彰他們在冷凍電子顯微鏡技術上的杰出貢獻，使電子顯微鏡在高真空環(huán)境下觀察接近生理狀態(tài)下的蛋白成為可能。
 

冷凍電鏡關鍵步驟：樣本制備
 

冷凍電鏡技術關鍵步驟是制備高質量的的樣本，即如何保證樣品分子顆粒均一的分布在厚度恰當?shù)牟Ａ�態(tài)冰層中決定著實驗結果的成敗�，F(xiàn)有冷凍樣本的樣本制備流程如下：

 

把載有樣品如緩沖液中的病毒、蛋白質和 DNA 組裝顆粒等的電鏡載網(wǎng)快速投入經(jīng)液氮冷卻的液態(tài)乙烷中，在載網(wǎng)孔或支持膜上形成約十幾到過百納米的玻璃態(tài)薄冰， 樣品顆粒則被分散包埋在其中而形成冷凍樣品。薄層水玻璃化法簡單快速， 適用于單顆粒生物樣品的研究， 此制樣技術被廣泛用于病毒、大分子及其復合體的研究。
 

冷凍電鏡樣本制備流程示意圖

 

現(xiàn)有冷凍電鏡樣本制備技術的缺陷

然而，傳統(tǒng)冷凍電鏡樣本制備方法存在缺陷：

1. 以手工或半自動設備，操作復雜，依賴較高的技巧
 

2. 采用blot方式，大量樣品被浪費在濾紙
 

3. 實驗的穩(wěn)定性和可重復性較差
 

4. 樣品存放的可追溯性差，容易導致樣品丟失
 

      總體而言，冷凍電鏡的樣品制備技術的不成熟已經(jīng)成為限制冷凍電鏡技術發(fā)展的關鍵性因素。為了解決這個核心問題，來自于英國SPT Labtech公司 (前身為TTP Labtech，其核心產(chǎn)品mosquito 在蛋白結晶篩選領域家喻戶曉) 最新研發(fā)了一款全自動冷凍電鏡樣本制備系統(tǒng): 變色龍(chameleon)，致力于解決目前樣本制備過程存在的上述種種問題。（變色龍：新一代冷凍電鏡全自動樣本制備系統(tǒng)）
 

變色龍 - 帶來冷凍電鏡樣本制備技術的革命性突破：全自動，blot free

變色龍在樣品制備中有以下特色：

1. 整個過程全自動，包括grid的夾取，點樣，拍照等操作，無人為干預，確保實驗的可重復性。

 

2. Blot-free：告別使用濾紙blot的時代。變色龍采用獨特的self-wicking 碳膜銅網(wǎng)，通過內(nèi)部納米銅纖維的毛細作用，幫助樣品在短時間內(nèi)迅速形成薄膜層。
 

3. 樣品使用量低：通過分液探頭，可將樣品快速噴至grid銅網(wǎng)上，最低僅需6 nL。
 

4.  快速plunge time：從噴點樣品至銅網(wǎng)上到置于液態(tài)乙烷進行快速冷凍，最快僅需54 毫秒，避免較長暴露在空氣中可能導致的樣品構象排列的傾向性。
 

5.  借助獨有的圖像算法軟件，在正式電鏡實驗前，提前獲得最優(yōu)化的冰層范圍以及相應的plunge time。
 

6. 專門設計的成像和軟件系統(tǒng)，追溯每個參數(shù)和實驗細節(jié)。
 

 

結束語
 

國內(nèi)冷凍電鏡應用領域的領軍人物，中國科學院院士、結構生物學家、西湖大學校長施一公曾表示，冷凍電鏡的發(fā)展像是一場猛烈的革命。“就目前發(fā)展前景來看，冷凍電鏡技術是可與測序技術、質譜技術相提并論的第三大技術！” 冷凍電鏡技術的突破給結構生物學領域帶來了一場大風暴，大量高分辨率的分子機器、膜蛋白、蛋白質復合物結構被報道，相關領域的研究也邁進了一個嶄新的時代。
 

作為冷凍電鏡關鍵的前序步驟: 樣本制備，新一代冷凍電鏡全自動樣本制備系統(tǒng)“變色龍”的出現(xiàn)，致力于改變現(xiàn)有傳統(tǒng)技術的種種缺陷，以期幫助科學家更加穩(wěn)定、高效地獲得高質量的冷凍電鏡樣本。