水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定濾膜法

水質(zhì)糞大腸菌群的測(cè)定濾膜法

1適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測(cè)定水中糞大腸菌群的濾膜法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中糞大腸菌群的測(cè)定。
本方法的檢出限：當(dāng)接種量為100ml時(shí)，檢出限為10CFU/L；當(dāng)接種量為500ml時(shí)， 檢出限為2 CFU/L。

2規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本 標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 14581水質(zhì)湖泊和水庫(kù)采樣技術(shù)指導(dǎo)
HJ494水質(zhì)采樣技術(shù)指導(dǎo)
HJ/T91地表水和污水監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)范

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3. 1糞大腸菌群 fecaI col iforms

又稱耐熱大腸菌群(thermotolerant coliforms)。44.5°C培養(yǎng)24h,能在MFC選擇性培養(yǎng) 基上生長(zhǎng)，發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，并形成藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落的腸桿菌科細(xì)菌。

3. 2菌落形成單位 colony-forming un i ts (CFU)

單位體積樣品中的細(xì)菌群落總數(shù)。

4方法原理

樣品通過孔徑為0.45um的濾膜過濾，細(xì)菌被截留在濾膜上，然后將濾膜置于MFC選 擇性培養(yǎng)基上，在特定的溫度(44.5°C)下培養(yǎng)24 h,膽鹽三號(hào)可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)， 糞大腸菌群能生長(zhǎng)并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸使指示劑變色，通過顏色判斷是否產(chǎn)酸，并通過呈藍(lán)色或 藍(lán)綠色菌落計(jì)數(shù)，測(cè)定樣品中糞大腸菌群濃度。

5干擾和消除

5.1活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1) 時(shí)加入硫代硫酸鈉溶液（6.6）消除干擾。

5.2重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品 采集（8.1）時(shí)加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.7）消除干擾。

6試劑和材料

除非另有說明，分析時(shí)均使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的分析純?cè)噭┗蛏�物試劑，�?shí)驗(yàn)用水為蒸餡 水或去離子水。
 

胰腺 10 g
蛋白腺 5g
酵母浸膏 3g
氯化鈉 5 g
乳糖 12.5 g
膽鹽三號(hào) 1.5 g
1%苯胺藍(lán)水溶液 10 ml
1%玫瑰紅酸溶液（溶于8.0 g/L氫氧化鈉液中） 10 ml

將上述培養(yǎng)基中的成分（除苯胺藍(lán)和玫瑰紅酸外），溶解于1000 ml水中，調(diào)節(jié)pH至 7.4,分裝于三角燒瓶?jī)?nèi)，于115°C高壓蒸汽滅菌20 min，儲(chǔ)存于冷暗處備用。臨用前，按上 述配方比例，用滅菌吸管分別加入巳煮沸滅菌的1%苯胺藍(lán)水溶液1 ml及1%玫瑰紅酸溶液 （溶于8.0 g/L氫氧化鈉液中）1ml,混合均勻。如培養(yǎng)物中雜菌不多，則不加玫瑰紅酸亦 可。加熱溶解前，加入1.2%〜1.5%瓊脂可制成固體培養(yǎng)基。也可選用市售成品培養(yǎng)基。配 制好的培養(yǎng)基避光、干燥保存，必要時(shí)在5°C±3°C冰箱中保存，分裝到平皿中的培養(yǎng)基可 保存2〜4周。配制好的培養(yǎng)基不能進(jìn)行多次融化操作，以少量勤配為宜。當(dāng)培養(yǎng)基顏色變 化，或脫水明顯時(shí)應(yīng)廢棄不用。
 

6. 3無菌水：取適量實(shí)驗(yàn)用水，經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌20 min,備用。

6.4 硫代硫酸鈉（Na2S2O3*5H2O）。

6.5 乙二胺四乙酸二鈉（CioHi4N208Na2.2H2。）。

6. 6 硫代硫酸鈉溶液：p （NazSzCh） =0.10 g/ml

稱取15.7 g硫代硫酸鈉（6.4）,溶于適量水中，定容至100 ml，臨用現(xiàn)配。

6.7 乙二胺四乙酸二鈉溶液：p （Ci₀Hi₄N2O₈Na2-2H2O） =0.15 g/ml

稱取15 g乙二胺四乙酸二鈉（6.5）,溶于適量水中，定容至100 ml,此溶液可保存30 d。

7儀器和設(shè)備

7. 1采樣瓶：1L、500 ml或250 ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。

7.2高壓蒸汽滅菌器：115°C、12 PC可調(diào)。

7.3恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差44.5°C ±0.5°C »

7.4過濾裝置：配有砂芯濾器和真空泵，抽濾壓力勿超過-50 kPa。

7.5 pH計(jì)：準(zhǔn)確到0.1 pH單位。

7. 6培養(yǎng)皿：直徑90 mm。

7.7 一般實(shí)驗(yàn)室常用儀器和設(shè)備。

注：玻璃器皿及采樣器具試驗(yàn)前要按無菌操作要求包扎，121笆高壓蒸汽滅菌20 min備用。

8樣品

8. 1樣品采集

點(diǎn)位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T 14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

采集微生物樣品時(shí)，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。樣 品采集量可根據(jù)水體實(shí)際情況而定，一般不少于250 ml。

采集河流、湖庫(kù)等地表水樣品時(shí)，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水 面10-15 cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶?jī)?nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水 中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的80%左右。樣 品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。

從龍頭裝置采集樣品時(shí)，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水3〜5 min, 然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3 min滅菌或用70%〜75%的酒精對(duì)龍頭進(jìn)行消毒，開足龍 頭，再放水1 min,以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時(shí)控制水流速度，小心接入瓶?jī)?nèi)。

采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時(shí)，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。

在同一采樣點(diǎn)進(jìn)行分層采樣時(shí)，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。

如果采集的是含有活性氯樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.6）,以除去 活性氯對(duì)細(xì)菌的抑制作用（每125 ml容積加入0.1 ml的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重 金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.7）,以消除干 擾（每125 ml容積加入0.3 ml的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。

注：15.7 mg硫代硫酸鈉（6.4）可去除樣品中1.5 mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實(shí)際活性氯 量調(diào)整。

8. 2樣品保存

采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測(cè)，否則，應(yīng)10°C以下冷藏但不得超過6h。實(shí)驗(yàn)室接樣后，不能 立即開展檢測(cè)的，將樣品在4°C以下冷藏并在2 h內(nèi)檢測(cè)。

9分析步驟

9. 1樣品過濾

根據(jù)樣品的種類判斷接種量，最小過濾體積為10ml,如接種量小于10ml時(shí)應(yīng)逐級(jí)稀釋。 先估計(jì)出適合在濾膜上計(jì)數(shù)所使用的體積，然后再取這個(gè)體積的1/10和10倍，分別過濾。理 想的樣品接種量是濾膜上生長(zhǎng)的糞大腸菌群菌落數(shù)為20〜60個(gè)，總菌落數(shù)不得超過200個(gè)。

當(dāng)最小過濾體積為10 ml,濾膜上菌落密度仍過大時(shí)，則應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。1:10稀釋的方法 為：吸取10ml樣品，注入盛有90 ml無菌水（6.3）的三角燒瓶中，混勻，制成1:10稀釋樣品。 樣品接種量參考

表見表1。

表1接種量參考表

 

 
用滅菌鑲子以無菌操作夾取無菌濾膜（6.2）貼放在己滅菌的過濾裝置（7.4）上，固定 好過濾裝置，將樣品充分混勻后抽濾，以無菌水（6.3）沖洗器壁2〜3次。樣品過濾完成后， 再抽氣約5 s,關(guān)上開關(guān)。

9.2培養(yǎng)

用滅菌鑲子夾取濾膜移放在MFC培養(yǎng)基（6.1）上，濾膜截留細(xì)菌面向上，濾膜應(yīng)與培 養(yǎng)基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將培養(yǎng)皿倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi),44.5°C ±0.5°C 培養(yǎng) 24h±2h。

9.3對(duì)照試驗(yàn)

每次試驗(yàn)都要用無菌水（6.3）按照步驟9.1和9.2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定。

9. 3. 2陽(yáng)性及陰性對(duì)照

將糞大腸菌群的陽(yáng)性菌株（如大腸埃希氏菌Escherichia coli）和陰性菌株（如產(chǎn)氣腸桿 菌Enterobacter aerogenes）制成濃度為40~600 CFU/L的菌懸液，分別按照9.1~9.2步驟培養(yǎng)， 陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無效，應(yīng)查 明原因后重新測(cè)定。

10結(jié)果計(jì)算與表示

10. 1結(jié)果判讀

MFC培養(yǎng)基上呈藍(lán)色或藍(lán)綠色的菌落為糞大腸菌群菌落，予以計(jì)數(shù)。

MFC培養(yǎng)基上呈灰色、淡黃色或無色的菌落為非糞大腸菌群菌落，不予計(jì)數(shù)。 結(jié)果判讀參考圖片見圖1。


無菌落生長(zhǎng)
 
圖1結(jié)果判讀參考圖片

10.2結(jié)果計(jì)算

樣品中的糞大腸菌群數(shù)（CFU/L），按照公式（1）進(jìn)行計(jì)算:

八 Ci*1000C =

式中：C——樣品中糞大腸菌群數(shù)，CFU/L；
Ci——濾膜上生長(zhǎng)的糞大腸菌群菌落總數(shù)，個(gè)；
1000——將過濾體積的單位由ml轉(zhuǎn)換為L(zhǎng) ；
/——樣品接種量，ml；

注：若平行樣結(jié)果都在20〜60 CFU/L范圍內(nèi)，最終結(jié)果取平均值以幾何平均計(jì)算。

10.3結(jié)果表示

測(cè)定結(jié)果保留至整數(shù)位，最多保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測(cè)定結(jié)果N100CFU/L時(shí)，以科學(xué) 計(jì)數(shù)法表示。糞大腸菌群檢驗(yàn)記錄及報(bào)告格式參見附錄A。

11精密度和準(zhǔn)確度

11.1精密度

6個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)低濃度（地下水，濃度均值為2.0X10² CFU/L）、中濃度（地表水，濃度 均值為

1.6X105CFU/L）和髙濃度（生活污水，濃度均值為1.6X10⁷ CFU/L）三個(gè)不同濃度 糞大腸菌群的實(shí)際

樣品和有證標(biāo)準(zhǔn)樣品（濃度為3670 MPN7L,可接受范圍為330〜 7710MPN/L）進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定：
實(shí)驗(yàn)室內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為5.3%〜12%、0.81%〜 2.1%、0.51%〜4.2%和7.7%〜9.8%；實(shí)驗(yàn)室間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.8%、3.9%、4.0%和3.6%； 實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間見表2 o

表2實(shí)驗(yàn)室間95%置信區(qū)間

 

 
11.2準(zhǔn)確度

6個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)含糞大腸菌群濃度為3670MPN7L （可接受范圍為330-7710 MPN/L）的標(biāo) 準(zhǔn)樣品進(jìn)行了6次重復(fù)測(cè)定：相對(duì)誤差范圍為-19%〜-32%；相對(duì)誤差最終值為：-23%±10%。

注：微生物檢測(cè)數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，其測(cè)定結(jié)果全部經(jīng)以10為底對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計(jì)算。

12質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

12. 1培養(yǎng)基檢驗(yàn)

更換不同批次培養(yǎng)基時(shí)要進(jìn)行陽(yáng)性和陰性菌株檢驗(yàn)，將糞大腸菌群測(cè)定的陽(yáng)性菌株（如 大腸埃希氏菌Escherichia coli）和陰性菌株（如產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenes）配成適 宜濃度，按樣品過濾（9.1）的要求使濾膜上生長(zhǎng)的菌落數(shù)為20〜60個(gè)，然后按培養(yǎng)（9.2）的要求進(jìn)行操作，陽(yáng)性菌株應(yīng)生長(zhǎng)為藍(lán)色或藍(lán)綠色菌落，陰性菌株應(yīng)生長(zhǎng)為灰色、淡黃色、 無色或無菌落生長(zhǎng)。否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

12.2對(duì)照試驗(yàn)

12.2. 1空白對(duì)照

每次試驗(yàn)都要用無菌水做實(shí)驗(yàn)室空白測(cè)定（9.3.1）,培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上不得有任何菌落 生長(zhǎng)。否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

12.2.2陽(yáng)性及陰性對(duì)照

定期按照9.3.2進(jìn)行陽(yáng)性及陰性對(duì)照試驗(yàn)，陽(yáng)性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，陰性菌株應(yīng)呈現(xiàn) 陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測(cè)定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測(cè)定。

13廢物處理

使用后的廢物及器皿須經(jīng)121°C髙壓蒸汽滅菌30 min或使用液體消毒劑（自制或市售） 滅菌后，器皿方可清洗，廢物作為一般廢物處置。

14注意事項(xiàng)

當(dāng)樣品渾濁度較高時(shí)，應(yīng)選用其他方法。