熒光免疫斑點FluoroSpot技術在新冠免疫學研究的應用

      【前情回顧】
       想同時進行多細胞因子檢測，你只需要一個“復聯(lián)”FluoroSpot

       眾所周知，免疫反應是由先天性免疫和適應性免疫細胞之間復雜的相互作用機制協(xié)調(diào)進行的。適應性免疫也就是后天免疫，其主要包括T淋巴細胞參與的體液免疫和B淋巴細胞參與的細胞免疫。

       而當機體要產(chǎn)生對抗病毒等病原體的永久免疫時，我們主要依靠的是細胞免疫，也就是可以分泌抗體的記憶B淋巴細胞，因為其可以對病毒等病原體保持長久的記憶，當病毒再次入侵機體時，記憶B細胞可以分泌大量抗體去對抗病毒，從而保護機體免受病毒的入侵。大多數(shù)情況下，B細胞效應本身并不能獨自完成這個過程。細胞免疫與體液免疫是相互配合，保持一致的。

       目前，機體內(nèi)的抗體滴度是否是一種對抗新冠病毒SARS-CoV-2入侵機體的免疫保護的標志物還存在很大爭議（了解更多信息請參見WHO網(wǎng)站）。因為，雖然由T輔助細胞和細胞毒性T細胞誘導的免疫效應在發(fā)揮機體保護性的作用方面起著非常重要的作用，但是我們也不要忘記T細胞還具有免疫監(jiān)視的作用。

       對此，Mabtech公司做了一個初步研究。在研究中，可以原位分析細胞的熒光免疫斑點法FluoroSpot技術發(fā)揮了重要作用。FluoroSpot可以高度靈敏地分析細胞所分泌的細胞因子--比流式等這些實驗方法的靈敏度還要高出數(shù)百倍。FluoroSpot技術可以直接用病毒多肽重復刺激細胞。Mabtech此次研發(fā)小組選擇了同時分析細胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，因為與單獨分析IFN-γ相比，同時分析IL-2，更可以全面評估T細胞對病毒感染反應（Chauvat et al，Hum Vaccin Immunother，2014）。同時，研發(fā)小組使用內(nèi)部開發(fā)的SARS-CoV-2 ELISA試劑盒分析研究了每個病人的抗體（IgG）水平，并將其與FluoroSpot數(shù)據(jù)進行了比較。
       SARS-CoV-2特異性T細胞的數(shù)量與抗體滴度成反比

       7個從輕癥到中度癥狀的新冠病毒肺炎康復者的血樣（經(jīng)過PCR確診）。 提取的PBMC已經(jīng)新冠病毒（SARS-COV-2）肽庫刺激，并以T細胞特異性肽庫作為陽性對照。 SARS-COV-2肽庫包括：15聚體與11個重疊的棘突蛋白和核衣殼蛋白的S1和S2結構域； JPT肽重疊。T細胞特異性肽庫包括：CMV肽庫, CEF延伸肽庫, CEFTA肽庫。T細胞反應是使用IFN-γ/IL-2 FluoroSpot分析（250,000個細胞/孔）在Mabtech IRIS上進行了分析。 此外，使用內(nèi)部開發(fā)的ELISA分析了SARS-CoV-2 棘突蛋白 RBD特異的IgG。

       根據(jù)上圖，我們得出這樣的結果：經(jīng)SARS-CoV-2多肽庫刺激后，所有COVID-19恢復期患者的Th1反應均為陽性。 其中有6個人的SARS-CoV-2特異性IgG水平升高，但其中一名（C7）的IgG水平低于ELISA檢測閾值。 有趣的是，這個通過抗體測試評估其COVID-19抗體效應為陰性的患者，其IFN-γ/ IL-2效應卻最強。

       所以從這項研究，我們發(fā)現(xiàn)一個有意思的現(xiàn)象，抗體滴度與T細胞反應之間的相關性似乎是相反的：抗體反應最低的三個患者（C4，C5和C7），卻具有最高的T細胞反應，即FluoroSpot分析中出現(xiàn)最高的IFN-γ/ IL-2的分泌細胞。但是由于，目前各方面的研究受限，我們尚不能得出這種相關性是否與疾病發(fā)展非常重要的結論。同樣地，我們也還沒有與疾病嚴重程度相關的數(shù)據(jù)。然而，這些數(shù)據(jù)為我們提出了一個重要問題：新冠病毒肺炎發(fā)病中，T細胞和B細胞之間是相互影響，互相作用的。

       而一篇最新發(fā)表的論文（Ni et al，Immunity, 2020) 展示了中和抗體滴度與病毒特異性T細胞數(shù)量之間呈正相關，也就是說這種結論暫時與我們的發(fā)現(xiàn)相反。這可能是因為受限于樣本人群的規(guī)模以及其疾病的嚴重程度等因素。但是，同樣在這篇文章中，也有一個康復期的病人樣本，抗體水平難以檢測到，使用IFN-γ ELISpot試劑盒卻檢測到了抗病毒作用的T細胞效應。

       如上所述，該研究小組只是展示初步的研究成果。而Mabtech 公司與法國國家健康研究院、法國國家科學研究中心、蔚藍海岸大學等研究機構的合作的、更大的研究項目還在進行中，以評估了該測定法對COVID-19患者的診斷和預后價值。

       為了更好的幫助廣大研究者方便研究新冠病毒肺炎，2020年05月18日Mabtech剛剛推出新冠病毒肽庫，SARS-CoV-2 S1 S2 N成分明確的肽庫。該肽庫已通過FluoroSpot和ELISpot的驗證，可以用于確診的新冠病毒康復患者的外周血單核細胞（PBMCs）體外刺激。而這些多肽的選擇是基于最新發(fā)表的文章Ahmed et al. (Viruses) 2020 。在這篇文章中作者描述了具有T細胞陽性反應的SARS-1抗原表位。甚至有一些表位對SARS-1 和 SARS-2都具有效應。這些抗原表位即是建立肽庫的基礎。SARS-CoV-2 S1 S2 N成分明確的肽庫共含有41個多肽，是基于棘突蛋白（S1和S2）和核蛋白（N）合成的多肽，分別是31種MHC-I肽和10種MHC-II肽。        Purified PBMCs prepared from three individuals previously PCR-confirmed for SARS-CoV-2 and PMBC from one pre-COVID-19 healthy control were stimulated with Mabtech's SARS-CoV-2 S1 S2 N defined peptide pool (250,000 cells/well). PHA stimulation (50,000 cells/well) was used as positive control stimulus. Unstimulated cells (250,000 cells/well). The T cell response was analyzed on Mabtech IRIS using an IFN-γ/IL-2 FluoroSpot assay。
       Human IFN-γ ELISpot. CD8+ cells were purified from whole blood using CD8 FAB-TACS (IBA Lifesciences). Cells (300,000 cells/well) were added to a pre-coated Human IFN-γ ELISpot plate and incubated overnight in the presence or absence of Mabtech’s SARS-CoV-2 S1 S2 N defined peptide pool.

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