Countstar Rigel 熒光分析儀在單細(xì)胞測(cè)序中的應(yīng)用

1.單細(xì)胞測(cè)序
單細(xì)胞測(cè)序（Single Cell Squencing）：簡(jiǎn)稱SCS，是指從單個(gè)細(xì)胞提取DNA或RNA樣品進(jìn)行DNA或RNA的測(cè)序。該技術(shù)自2009年問(wèn)世，2013年被Nature Methods評(píng)為年度技術(shù)以來(lái)，越來(lái)越多地被應(yīng)用在科研領(lǐng)域。2015年以來(lái)，10X Genomics、Drop-seq、Micro-well、Split-seq等技術(shù)的出現(xiàn)，大大降低了單細(xì)胞測(cè)序的成本門(mén)檻。目前，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用在腫瘤異質(zhì)性研究、干細(xì)胞發(fā)育和分化、人類(lèi)細(xì)胞圖譜構(gòu)建、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫方向、胚胎細(xì)胞發(fā)育研究、疾病分型等多方面。

2.單細(xì)胞測(cè)序的優(yōu)勢(shì)
與傳統(tǒng)高通量測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序一次檢測(cè)量可達(dá)100-200Gb，包含1000~6000個(gè)不同細(xì)胞的基因表達(dá)，超高通量可以對(duì)6000~10000個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。它的優(yōu)勢(shì)也體現(xiàn)在以下幾點(diǎn)：
①能準(zhǔn)確區(qū)分細(xì)胞群體，并進(jìn)行細(xì)胞類(lèi)別間的比較；
②能找到稀有細(xì)胞的表達(dá)情況；
③準(zhǔn)確分析每一個(gè)細(xì)胞的基因表達(dá)；
④能對(duì)于微環(huán)境中的細(xì)胞間關(guān)系進(jìn)行分析解讀；
⑤從表達(dá)量，細(xì)胞量，細(xì)胞組成等多角度對(duì)樣本進(jìn)行分析。

3.單細(xì)胞測(cè)序的不同技術(shù)
①斯坦福大學(xué)Stephen Quak研發(fā)的基于芯片技術(shù)的單細(xì)胞測(cè)序，該技術(shù)設(shè)計(jì)了一種路線，用液體載運(yùn)細(xì)胞通過(guò)一連串顯微管道和微閥門(mén)，當(dāng)細(xì)胞挨個(gè)進(jìn)入各自的小空位時(shí)，它們的DNA就會(huì)被提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)復(fù)制用于進(jìn)一步分析。該方法不僅能分離細(xì)胞，還能用化學(xué)試劑將細(xì)胞混合起來(lái)，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)過(guò)程中的熒光發(fā)射獲得它們的基因編碼。所有這些都能在芯片上完成，不僅操作簡(jiǎn)單，而且成本效益高。目前應(yīng)用在研究精子細(xì)胞的重組和突變率。
②美國(guó)科學(xué)院院士謝曉亮教授研發(fā)的多重退火和成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)降低PCR擴(kuò)增偏倚，使得單細(xì)胞中93%的基因組能夠被測(cè)序。這種方法使得檢測(cè)單細(xì)胞中較小的DNA序列變異變得更容易，因此能夠發(fā)現(xiàn)個(gè)別細(xì)胞之間的遺傳差異。這樣的差異可以幫助解釋癌癥惡化的機(jī)制，生殖細(xì)胞形成機(jī)制，甚至是個(gè)別神經(jīng)元的差異機(jī)制。
③深圳華大基因研究院研發(fā)的基于多重置換擴(kuò)增（MDA）的單細(xì)胞測(cè)序，該方法不僅具有更高的分辨率和基因組覆蓋度，而且具有更好的敏感性和特異性。該方法從單核苷酸水平上為各種復(fù)雜疾病和生物學(xué)過(guò)程的研究開(kāi)辟了新思路。
④加拿大英屬哥倫比亞大學(xué)Peter Lansdorp研發(fā)的Strand-seq技術(shù)，該方法能分別對(duì)單細(xì)胞的雙親DNA模板鏈進(jìn)行測(cè)序，獲得高分辨率的姊妹染色體交換圖譜，檢測(cè)到基因重排，從而發(fā)現(xiàn)細(xì)胞復(fù)制過(guò)程中DNA序列的翻轉(zhuǎn)或交換。利用Strand-seq方法，研究人員完成了單鏈DNA測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)了首個(gè)基因組壓力和不穩(wěn)定性的痕跡。

4.單細(xì)胞測(cè)序的實(shí)驗(yàn)流程
①采集細(xì)胞樣品：用酶消化的方法獲取單細(xì)胞消化懸液；
②細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性檢測(cè)：檢測(cè)單細(xì)胞懸液中細(xì)胞的活性狀態(tài)，并完成細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算上樣量。對(duì)細(xì)胞質(zhì)量的要求是：細(xì)胞活性大于70%，濃度為500~2000個(gè)細(xì)胞/ml，上機(jī)細(xì)胞數(shù)不高于10000個(gè)。
③單細(xì)胞分離：將單細(xì)胞懸液標(biāo)記特定的barcode，用單細(xì)胞捕獲設(shè)備捕獲。
④單細(xì)胞建庫(kù)：通過(guò)RNA反轉(zhuǎn)錄、PCR等步驟獲得可以上機(jī)測(cè)序的DNA文庫(kù)。
⑤上機(jī)測(cè)序：使用測(cè)序平臺(tái)對(duì)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄文庫(kù)進(jìn)行高通量檢測(cè)。
⑥數(shù)據(jù)分析：對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和解讀。

5. Countstar Rigel 熒光分析儀在單細(xì)胞測(cè)序中的應(yīng)用
單細(xì)胞測(cè)序過(guò)程中需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行濃度和活率的精確計(jì)數(shù)，多數(shù)細(xì)胞樣本是從組織中消化下來(lái)的，含有更多地細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，傳統(tǒng)的計(jì)數(shù)方法不能排除這些雜質(zhì)和碎片的干擾。Countstar Rigel全自動(dòng)熒光分析儀是一款基于圖像法檢測(cè)、配合多熒光通道，通過(guò)采集圖像中的細(xì)胞信息，進(jìn)行定量分析。它將熒光顯微成像與統(tǒng)計(jì)學(xué)群體分析結(jié)合于一身，既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以獲得單個(gè)細(xì)胞的圖像，從而提供細(xì)胞形態(tài)學(xué)信息。它結(jié)合AO（丫啶橙）和PI（碘化丙啶）兩種核酸染料，通過(guò)熒光染色和圖像識(shí)別法對(duì)細(xì)胞濃度和活率進(jìn)行精確計(jì)數(shù)（如圖1），有效地排除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)的干擾（如圖2），并可提供多種導(dǎo)出格式（如圖3），是單細(xì)胞測(cè)序過(guò)程中的好伙伴。