miR-124-3p負(fù)調(diào)控Lamin A/C來調(diào)節(jié)循環(huán)拉伸過程中平滑肌細(xì)胞凋亡

血管平滑肌細(xì)胞 (VSMCs) 是動(dòng)脈的主要細(xì)胞成分，是血管疾病的關(guān)鍵決定因素。 VSMC 的凋亡已被證明是高血壓環(huán)境中動(dòng)脈重塑的重要過程。在全身性高血壓動(dòng)脈重塑過程中，促進(jìn)VSMC凋亡，細(xì)胞外膠原合成和降解失衡，導(dǎo)致血管壁膠原過度沉積。

在高血壓期間，機(jī)械循環(huán)牽張力（定義為血管壁隨著心動(dòng)周期有節(jié)奏地?cái)U(kuò)張和松弛時(shí)細(xì)胞的重復(fù)變形）顯著增加。機(jī)械循環(huán)拉伸可誘導(dǎo)VSMCs 的表型轉(zhuǎn)換、增殖、凋亡和遷移。許多機(jī)械響應(yīng)信號(hào)通路已被證明受循環(huán)拉伸的影響，包括 PI3K/Akt、NFκB、和 MAPK 通路等。

此外，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的細(xì)胞骨架蛋白也對(duì)不同程度的循環(huán)拉伸有反應(yīng)。例如，循環(huán)拉伸誘導(dǎo)微絲的調(diào)整和重組。研究表明，核纖層蛋白 A 和 emerin 是細(xì)胞核中重要的細(xì)胞骨架蛋白，它們對(duì)循環(huán)拉伸和剪切應(yīng)力都有反應(yīng)。

核纖層蛋白（Lamins） 是核中間絲蛋白，構(gòu)成核纖層的結(jié)構(gòu)成分，核纖層是內(nèi)核膜下方的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，決定核的形狀和大小。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了兩種類型的核纖層蛋白：A 型核纖層蛋白，包括核纖層蛋白 A、C、A∆10 和 C2，由單個(gè)基因 (Lmna) 編碼，在分化細(xì)胞中發(fā)育調(diào)節(jié)和表達(dá)；B 型核纖層蛋白，包括核纖層蛋白 B1 和 B2/B3，由兩個(gè)不同的基因編碼，并在所有細(xì)胞中表達(dá)。在機(jī)械反應(yīng)過程中，核纖層蛋白 A 和 C （lamin A/C ）是已被廣泛研究的應(yīng)力敏感分子。盡管研究已經(jīng)證明不同類型的機(jī)械刺激可以調(diào)節(jié) lamin A/C，但這些過程中涉及的詳細(xì)機(jī)制仍不清楚。

基于此，上海交通大學(xué)機(jī)械生物學(xué)與醫(yī)學(xué)工程研究所、北京航空航天大學(xué)生物力學(xué)與力學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的專家學(xué)者進(jìn)行了研究，初步表明，泛素降解途徑的抑制部分逆轉(zhuǎn)了異常循環(huán)拉伸對(duì) lamin A/C 的抑制。然而，這個(gè)逆轉(zhuǎn)過程并不完整，這表明還有其他調(diào)控機(jī)制影響了 lamin A/C 的表達(dá)。

因此，研究人員進(jìn)一步研究，試圖證明在異常循環(huán)拉伸下 lamin A/C 表達(dá)改變的機(jī)制，并進(jìn)一步檢測(cè)這種表達(dá)改變?cè)?VSMC 凋亡中的作用。相關(guān)研究成果發(fā)表在 Acta Physiologica 題為《Lamin A/C negatively regulated by miR-124-3p modulates apoptosis of vascular smooth muscle cells during cyclic stretch application in rats》。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

病理性循環(huán)牽張力抑制Lamin A/C的表達(dá)并誘導(dǎo)VSMCs凋亡

機(jī)械周向應(yīng)力會(huì)因高血壓而顯著增加，這會(huì)導(dǎo)致彈性血管發(fā)生更強(qiáng)烈的變形。使用循環(huán)牽張力加載系統(tǒng)，在體外對(duì)VSMCs 施加不同幅度的循環(huán)拉伸。

與5% 的循環(huán)拉伸(模仿正常張力的生理拉伸)相比，15% 的循環(huán)拉伸(模擬高血壓的病理拉伸)顯著增加了VSMCs的凋亡，這是通過Annexin V/PI染色(圖1A)和裂解的半胱天冬酶 3 ELISA（圖1B）檢測(cè)到的。

此外，還研究了不同程度循環(huán)拉伸后 lamin A/C 的蛋白表達(dá)情況。與5%-CS相比，15%-CS降低了lamin A(在6、12和24小時(shí))(圖1C)和lamin C(在24小時(shí)但在6或12小時(shí)沒有)(圖1D)的表達(dá)。

這些結(jié)果表明病理性升高的循環(huán)拉伸誘導(dǎo)了 VSMC 細(xì)胞凋亡并抑制了 lamin A/C蛋白的表達(dá)。

圖 1

抑制 lamin A/C 的表達(dá)可誘導(dǎo)VSMCs的凋亡

由于病理性循環(huán)拉伸下lamin A/C表達(dá)的改變伴隨著細(xì)胞凋亡的變化，于是檢測(cè)lamin A/C是否參與了凋亡的調(diào)控。

在靜態(tài)條件下，使用特異性siRNA降低lamin A/C 的表達(dá)（圖1 E）。靜態(tài)條件下，敲低Lamin A/C顯著增加VSMCs的凋亡 (圖1 F、G)。

總之，對(duì)拉伸作用下 lamin A/C 表達(dá)和VSMC凋亡的研究結(jié)果表明，病理性循環(huán)拉伸對(duì) lamin A/C 的抑制可能有助于調(diào)節(jié)VSMC凋亡的。

lamin A/C表達(dá)的降低不受轉(zhuǎn)錄或自噬的調(diào)控

由于 lamin A/C 的蛋白表達(dá)在 15%-CS 下降低，實(shí)驗(yàn)隨后探索了該過程中的潛在機(jī)制。雖然初步實(shí)驗(yàn)揭示了泛素降解途徑在該過程中的部分作用，但進(jìn)一步檢測(cè)了 lamin A/C 表達(dá)的詳細(xì)調(diào)控機(jī)制。

首先，檢測(cè)了不同程度的循環(huán)拉伸對(duì) lamin A/C 的 mRNA Lmna 表達(dá)的影響。結(jié)果表明，在6、12和24小時(shí)，5%-CS和15%-CS組間的Lmna表達(dá)無顯著差異(圖2A)。這一發(fā)現(xiàn)表明病理性循環(huán)拉伸可能不會(huì)改變 lamin A/C 的轉(zhuǎn)錄。

此外，還探索了自噬，一種參與lamin B 降解的機(jī)械響應(yīng)性蛋白降解機(jī)制，對(duì)lamin A/C 表達(dá)的影響。兩種自噬抑制劑 Baf 和 CQ 均顯著抑制了 VSMCs 中的自噬（圖2 B、C、F），但對(duì) lamin A/C 的蛋白表達(dá)沒有顯著影響（圖2 D、E、G、H ）。然后，檢測(cè)了 lamin A/C 表達(dá)的可能的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制。

圖 2

miR-124-3p降低lamin A/C的表達(dá)

MiRs 是重要的內(nèi)源性非編碼 RNA 分子，通過靶向特定的 mRNA 并誘導(dǎo)其降解或翻譯抑制來負(fù)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)。為了識(shí)別 lamin A/C 調(diào)節(jié)中可能的 miRs，對(duì)三個(gè)在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索。結(jié)果表明，miR-124-3p在Lmna 3'UTR中有兩個(gè)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)(圖2 I)，說明miR-124-3p可能負(fù)調(diào)控lamin A/C 的表達(dá)。

隨后，miR-124-3p 在 VSMCs 中分別使用特定的模擬物或抑制劑過表達(dá)或敲低。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果表明，miR-124-3p模擬物顯著降低 lamin A/C的蛋白質(zhì)表達(dá)（圖2 K），而抑制劑增加了lamin A/C水平(圖2 L)。這些結(jié)果表明 miR-124-3p 在 lamin A/C 表達(dá)的調(diào)節(jié)中起重要作用。

MiR-124-3p 在 Lmna 的 3'UTR 有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)

使用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)評(píng)估 miR-124-3p 對(duì) Lmna 3'UTR 的兩個(gè)獨(dú)立靶位點(diǎn)的結(jié)合和抑制能力。結(jié)果表明， Lmna 3'UTR 中的兩個(gè)靶向位點(diǎn)在 miR-124-3p 下調(diào) lamin A/C 蛋白的表達(dá)中很重要。

然后檢查了 miR-124-3p 對(duì) VSMC 凋亡的影響，結(jié)果顯示，miR-124-3p 模擬物顯著加速了 VSMCs 的凋亡，抑制物減弱了VSMCs的凋亡。

以上結(jié)果表明，miR-124-3p通過靶向Lmna 3'UTR上的兩個(gè)位點(diǎn)負(fù)調(diào)控lamin A/C的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)VSMCs的凋亡。

抑制miR-124-3p可逆轉(zhuǎn)循環(huán)牽張引起的Lamin A/C表達(dá)和VSMC凋亡

實(shí)驗(yàn)探討了 miR-124-3p 是否具有機(jī)械敏感性，，以及在循環(huán)拉伸過程中是否參與調(diào)控 lamin A/C 表達(dá)和 VSMC 凋亡。與暴露于 5%-CS 相比，暴露于 15%-CS 6、12 和 24 小時(shí)顯著增加了 miR-124-3p 的表達(dá)（圖3 A），這表明 miR-124-3p 也是一種機(jī)械敏感性分子。與對(duì)照組相比，miR-124-3p 抑制劑在 5%- 和 15%-CS 條件下均降低了 VSMCs 的凋亡（圖3 B、C、D），同時(shí)增加了 lamin A/C 的蛋白表達(dá)（圖3 E、F)。

這些結(jié)果表明 miR-124-3p-lamin A/C 通路參與了 15%-CS 促進(jìn)的 VSMC 凋亡。

圖 3

lamin A/C 的下調(diào)可調(diào)控 VSMCs 中各種 TFs 的激活

據(jù)報(bào)道，核被膜 (NE) 蛋白調(diào)節(jié) DNA 合成、染色質(zhì)組織和基因轉(zhuǎn)錄。因此，使用 IPA 生物信息學(xué)軟件尋找可能與 lamin A/C 和 emerin 相互作用的潛在下游轉(zhuǎn)錄因子。首先發(fā)現(xiàn)了4個(gè)由lamin A/C和emerin共同調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，然后通過蛋白質(zhì)/DNA微陣列，發(fā)現(xiàn)lamin A/C或emerin的siRNA激活變化均超過2倍。

這些發(fā)現(xiàn)表明 lamin A/C 和emerin可調(diào)節(jié)TFs的活性，TFs可能參與了VSMC凋亡的調(diào)控。

高血壓在體內(nèi)誘導(dǎo)miR-124-3p的表達(dá)并抑制lamin A/C的表達(dá)

使用腹主動(dòng)脈縮窄高血壓模型，在體內(nèi)探索 VSMCs 的變化。最終結(jié)果顯示，miR-124-3p/lamin A/C可能參與了高血壓引起的異常循環(huán)牽張誘導(dǎo)的VSMCs凋亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

總之，這項(xiàng)研究表明 NE 蛋白 lamin A/C 是 VSMCs 中的機(jī)械敏感分子。病理性升高的循環(huán)拉伸通過上調(diào) miR-124-3p 抑制 lamin A/C 的表達(dá)，進(jìn)而可能調(diào)節(jié)不同 TFs 的激活并最終影響 VSMCs 的凋亡。這些結(jié)果提供了證據(jù)，表明循環(huán)拉伸通過 NE 蛋白介導(dǎo)的機(jī)制調(diào)節(jié) VSMC 的功能，并闡明了核骨架蛋白在機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。

該研究可能為理解高血壓 VSMC 功能障礙的機(jī)制提供新的見解，并可能為在生理和病理上維持 VSMC 穩(wěn)態(tài)提供一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：Bao H, Li HP, Shi Q, Huang K, Chen XH, Chen YX, Han Y, Xiao Q, Yao QP, Qi YX. Lamin A/C negatively regulated by miR-124-3p modulates apoptosis of vascular smooth muscle cells during cyclic stretch application in rats. Acta Physiol (Oxf). 2020 Mar;228(3):e13374. doi: 10.1111/apha.13374. Epub 2019 Sep 27. PMID: 31495066.

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