TRAP銀染法端粒酶活性檢測試劑盒詳細使用說明書
TRAP銀染法端粒酶活性檢測試劑盒
產(chǎn)品信息：Kim于1994年借助PCR技術(shù)建立了靈敏的端粒酶檢測方法——端粒重復(fù)片段擴增(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。本產(chǎn)品是在其方法的基礎(chǔ)上，進行適當(dāng)改良，開發(fā)出來的研究用試劑盒。
本品與通常的端粒酶活性測定法相比較，具有以下特征：
1、內(nèi)標(biāo)與端粒酶提取液在同一管里進行PCR擴增，提高了檢測的準確性。
2、提供了陽性對照，可以更加準確地判定陽性實驗結(jié)果。
3、優(yōu)化了引物設(shè)計，使PCR 效果進一步提高。
使用須知：本試劑盒為研究用試劑，不能將其作為診斷或臨床檢測試劑使用。
背景知識：端粒酶是合成染色體末端的端粒的酶。端粒（telomere）是真核細胞染色體的天然末端，由上千個6堿基重復(fù)序列(TTAGGG)組成，是細胞必需的遺傳組分，它的作用是維持端粒有足夠的長度，保證基因信息在復(fù)制過程中的準確性，以防止染色體末端遺傳信息的丟失。在正常情況下，每個細胞分裂周期都會使端粒變的越來越短，當(dāng)端粒短到一定程度時就會發(fā)出信號，細胞停止分裂。
端粒酶由RNA和蛋白質(zhì)亞基組成，是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，在細胞染色體復(fù)制過程中，能夠以自身RNA為模板，在染色體3’末端合成重復(fù)序列，維持端粒的長度。端粒酶在正常體細胞中的活性被抑制，但是大量的資料表明在一些惡性腫瘤中的表達高達85%。
由于端粒酶特異地表達于各種腫瘤細胞，并且是大多數(shù)腫瘤細胞持續(xù)分裂所必需的。因此，端粒酶活性是診斷多數(shù)惡性腫瘤、判斷愈后的良好指標(biāo)。
基本原理：利用端粒酶在體外可以以其自身RNA的模板區(qū)為模板，在適宜的寡核苷酸鏈的末端添加6個堿基的重復(fù)序列的特性，采用PCR方法擴增此重復(fù)序列，并進而用聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳顯示6個堿基差異的梯帶。1994年Kim建立的TRAP法，其主要原理如下：首先合成一個18nt的TS做上游引物，端粒酶結(jié)合TS末端的GTT并合成AGGGTTAG，然后每經(jīng)過一次轉(zhuǎn)位合成一個ggttag的6堿基重復(fù)序列，端粒酶滅活后，加入CX做下游引物，經(jīng)過多次變性-退火-延伸，擴增端粒酶延伸產(chǎn)物。
TBD-PCR端粒酶活性檢測試劑盒基于同樣的的原理，利用銀染技術(shù)檢測端粒酶的活性。陽性結(jié)果在凝膠電泳上顯示相隔6bp的梯狀條帶，條帶的多、寡、深或淺表示端粒酶活性的大小。TRAP-銀染法保留了傳統(tǒng)TRAP法靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，避免了同位素的放射污染。同時，還增設(shè)了內(nèi)標(biāo)準物，提供陽性對照品，優(yōu)化了引物設(shè)計，使PCR效果進一步提高，使之能夠高靈敏的檢測到細胞和組織提取物中端粒酶的活性。
試劑盒組成：
| 組分 | 50 次實驗量 |
| Wash buffer | 11ml |
| Lysis buffer | 2.2ml |
| 10×PCR buffer | 140μl |
| dNTPs | 165μl |
| Primer1 | 165μl |
| Primer2 | 28μl |
| Primer3 | 110μl |
| Taq -DNA Polymerase | 17μl |
| ddH2O | 750μl |
| 陽性對照模板 | 55μl |
| 內(nèi)標(biāo)準模板 | 55μl |
操作步驟
1、端粒酶的提取
⑴ 手術(shù)后取下的活組織，立即保存在液氮之中。
⑵ 40～100mg 冷凍（-70％℃）組織用無菌眼科手術(shù)剪盡量剪碎，研磨器研磨，加入 40 ul Lysis buffer（使用前每 ml Lysis buffer 加入 2μl β-巰基乙醇）；或 1～2×106 沉淀細胞直接加入 40µl 預(yù)冷的 Lysis buffer，懸浮細胞，渦旋振蕩10s, 置冰浴中 30min，每間隔數(shù)分鐘渦旋振蕩一次，共 5-6 次。
備注：為了獲取比較理想的端粒酶提取液，建議在一些干硬組織中適當(dāng)加入 Wash buffer。
⑶ 4℃離心（13000rpm,20min）。
⑷ 移取上清，分裝 3-4 管，每管約 20μl。其中一份樣品用于蛋白質(zhì)濃度定量，其余迅速冷凍，-70℃保存。
2、PCR 擴增(1×25ul)
| Ⅰ液（μl） | Ⅱ液（μl） | |
| ddH2O | 7.5 | 5.5 |
| 10×buffer | 0.5 | 2 |
| dNTPs | 0.5 | 2.5 |
| Primer1 | 0.5 | 2.5 |
| Primer 2 | 0.5 | |
| Taq-DNA polymerase | 0.3 |
3、PCR 擴增：
⑴ 每管加入Ⅰ液 9μl 及端粒酶提取液 1μl，混勻，30℃反應(yīng) 30min。
⑵ 上述各管 93℃加熱 1min 滅活。
⑶ 向上述各管中加入預(yù)熱至 93℃的Ⅱ液各 13ul，混勻，進行第一步擴增。擴增條件如下：
第一步：
| 步驟 | 時間 | 溫度 |
| 預(yù)變性 | 3m | 93℃ |
| 變性 | 35s | 93℃ |
| 退火 | 35s | 42℃ |
| 延伸 | 90s | 72℃ |
| 循環(huán)數(shù) | 5 | |
| 延伸 | 60s | 72℃ |
（4）在第一步擴增最后一個循環(huán)的延伸一步的最后幾秒，暫停儀器運行，快速向各管中加入primer3 2ul 和稀釋后的內(nèi)標(biāo)準模板1ul。繼續(xù)運行儀器，進行第二步擴增。擴增條件如下：
第二步（連接第一步）：
| 步驟 | 時間 | 溫度 |
| 預(yù)變性 | 60s | 93℃ |
| 變性 | 40s | 93℃ |
| 退火 | 40s | 60℃ |
| 延伸 | 50s | 72℃ |
| 循環(huán)數(shù) | 36 | |
| 延伸 | 8m | 72℃ |
4、10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（所有溶液，用戶自備）
⑴ 制備 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠（20ml）。
ddH2O 11.19 ml
36%Acr-1%Bis 5.46 ml
5%TEMED 0.4 ml
10×電泳緩沖液 2 ml
1.25% APS 1 ml
⑵ 取10ul PCR產(chǎn)物與2ul上樣緩沖液混合后加樣，用0.5×電泳緩沖液作為電極緩沖液，180V電泳2h。
⑶ 小心剝離凝膠，并置于50%甲醇、10%醋酸中，固定過夜。
備注：
① 10×電泳緩沖液：15g Tris 、14g 硼酸和1.17g EDTA (不帶 2Na) ，用ddH2O定容至 200ml。
② 10×上樣緩沖液：0.01%溴酚蘭、40%甘油、62.5mM Tris-HCl(pH6.7)
5、銀染（所有溶液，用戶自備）
⑴ 將凝膠置于 10%醋酸固定30min后用蒸餾水漂洗3次，每次5min;
⑵ 將凝膠置于0.2g/L 硫代硫酸鈉浸泡1min, 然后用蒸餾水漂洗3次，每次30s;
⑶ 將凝膠置于硝酸銀染液中浸泡 30min, 然后用蒸餾水漂洗 30s;
⑷ 將凝膠置于顯影液中顯色 10min 左右直到全部條帶顯色清晰為止；
⑸ 將凝膠置于 5%醋酸中浸泡終止反應(yīng)。
⑹ 選擇適當(dāng)時機照相。
備注：
① 硝酸銀染液：0.2g AgON3、25ul 37%甲醛，定容至 100ml。
② 顯色液：3g Na2CO3、25ul 37%甲醛、0.4mg 硫代硫酸鈉，定容至 100ml。
6、使用凝膠分析軟件進行結(jié)果分析
實驗方法的說明
1、端粒酶的提取：端粒酶本身有RNA 和酶功能基團，極其容易被降解、失活。因此，應(yīng)該按提取細胞總RNA 的要求，盡量在低溫條件下，快速操作。簡化不必要的反復(fù)洗滌程序，提高提取液的蛋白質(zhì)濃度。小量分裝，盡量避免反復(fù)凍融。2、反應(yīng)前，測定每個樣品的蛋白質(zhì)濃度，并稀釋至同一濃度，以保證端粒酶樣品加入量基本一致。
3、為了讓實驗更具有客觀性，實驗時，請務(wù)必設(shè)定陽性對照和陰性對照，本試劑盒提供陽性對照的模板，并提供陰性對照的實驗方法。陽性對照的實驗方法：另設(shè)一陽性對照管，以陽性對照模板代替端粒酶提取液加入即可。陰性對照的實驗方法：可以把I液II液混合，每管24ul混合液，再加入端粒酶提取液，混勻后直接在90℃加熱10min滅活，不經(jīng)過PCR擴增，直接電泳，以排除樣品中存在的蛋白質(zhì)對核酸銀染的干擾。
4、關(guān)于內(nèi)標(biāo)準模板的使用為了便于進行各樣品間端粒酶活性的比較，我們提供了內(nèi)標(biāo)準物。該內(nèi)標(biāo)準物可以作為模板，用于檢測端粒酶活性的同一對引物進行擴增。內(nèi)標(biāo)準模板擴增片段長度為：50bp。
該內(nèi)標(biāo)準物的使用有兩種方法：
第一種方法：將內(nèi)標(biāo)準物以一定量加入到端粒酶樣品之中，用同一對引物在同一擴增管內(nèi)進行競爭性擴增。然后通過比較電泳圖譜中內(nèi)標(biāo)準物和端粒酶擴增帶的相對強度，即可達到相對定量的目的�？紤]到實驗方法的靈敏度，并避免PCR 擴增時的平臺效應(yīng)，只有當(dāng)端粒酶的模板（與其活性相對應(yīng)）和內(nèi)標(biāo)的模板比例相接近時，方能得到較理想的分析效果。
基于不同來源樣品的端粒酶的活性不同，需要將高濃度的模板進行一系列的稀釋，比如依次稀釋為100、1000、10000、100000、1000000 等倍數(shù)，分別取1ul與等體積的端粒酶樣品混合后作為模板，進行擴增。選擇一個內(nèi)標(biāo)準物和端粒酶均能明顯擴增的稀釋度用于今后的實驗。此種方法從理論上講更嚴謹，考慮到了模板的長度，擴增效果和端粒酶活性的關(guān)系，但是需要客戶自己摸索最佳條件。實驗室建議在端粒酶活性比較高的情況下將內(nèi)標(biāo)準模板稀釋105再進行擴增。
第二種方法：是將我們提供的高濃度內(nèi)標(biāo)準物，在進行電泳時加入。這樣也能夠?qū)崿F(xiàn)半定量分析，而且方法簡單可行。
常見問題
1、細胞提取物中沒有足夠的端粒酶：在冰浴條件下制備細胞和組織提取物，盡量縮短制備時間，適當(dāng)用較高濃度的端粒酶樣品，減少不必要的操作。
2、端粒酶的反應(yīng)時間不夠：保證反應(yīng)時間不少于20min。
3、所有樣品和陰性對照都成陽性：PCR殘余污染。PCR反應(yīng)的每一組分勿重復(fù)使用保證使用潔凈的PCR管和PCR試管架
4、同一種組織會有不同的端粒酶的表達活性：動物本身就有種內(nèi)差，每個個體的端粒酶的表達活性情況也會不一樣。同一個體的不同組織（如睪丸/骨髓）端粒酶的表達也不一定相同。同一個體的同一組織的不同部位端粒酶的表達情況也不一定相同。
5、腫瘤組織中沒有出現(xiàn)預(yù)期的端粒酶條帶：腫瘤組織中端粒酶的表達達85%，也有部分腫瘤組織中沒有端粒酶的表達，所以極少數(shù)腫瘤組織中有可能沒有出現(xiàn)端粒酶的條帶。
6、陽性對照中看不到梯度：因反復(fù)凍融會導(dǎo)致陽性對照中的端粒酶失活，所以應(yīng)注意低溫操作。
7、陰性對照里有梯度條帶出現(xiàn)：PCR產(chǎn)物、lysis buffer及反應(yīng)試劑等交叉污染，請將PCR擴增產(chǎn)物提取區(qū)域和反應(yīng)試劑配制區(qū)域分開。另外請經(jīng)常使用手套。電泳上樣時的交叉污染，每次上樣時更換槍頭。
8、由于熱處理、RNase處理不充分而引起梯度條帶消失：將要使用的槍頭用DEPC水浸泡至少24小時，再進行高壓滅菌，烤干；提取樣品所用的玻璃制品、陶瓷品及手術(shù)器械等經(jīng)烤箱170℃烘烤5個小時。
9、端粒酶活性不高：改善端粒酶反應(yīng)條件，適當(dāng)增加端粒酶反應(yīng)時間，適當(dāng)增加PCR循環(huán)數(shù)（但要避免達到平臺效應(yīng)，使非特異性擴增大量出現(xiàn)），避免lysis buffer的惡化，盡量減少端粒酶樣品反復(fù)凍融。實驗操作的指導(dǎo)原則是快速，低溫。
質(zhì)量檢測報告：
產(chǎn)品名稱：TRAP-銀染法端粒酶活性檢測試劑盒（TRAP-Silver Staining Telomerase Detection Kit）
HL-60細胞在37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并利用本試劑盒進行檢測，經(jīng)電泳檢測PCR產(chǎn)物，呈現(xiàn)陽性梯帶，視為合格。
