生物分析解決方案應用案例：Merck雙特異性抗體表征方法的建立

牛IgG具有高達70個氨基酸的超長CDR-H3結構域。之前發(fā)現(xiàn)，具有牛的CDR-H3的HIV中和抗體會識別gp120 CD4結合位點上的表位，該表位通常凹陷于常規(guī)抗體。所以超長CDR-H3抗體可能會識別一些人抗體無法識別的隱蔽表位，并擴大抗體識別的靶點區(qū)域^[1]。

應用案例
德國默克（Merck）的科學家們設計了基于牛CDR-H3雙特異性抗體，靶向腫瘤細胞上的表皮生長因子受體（EGFR）以及自然殺傷（NK）細胞上的天然細胞毒性受體NKp30�；�于牛IgG的雙特異性抗體（BsAbs）引發(fā)了有效的NK細胞重定向，從而引發(fā)了EGFR過表達的腫瘤細胞裂解以及促炎細胞因子的強勁釋放^[2]。
  牛源CDR-H3雙特異性抗體的產生示意圖。通過�？贵w文庫篩選出針對兩個靶標（以紅色和黃色顯示）的識別序列。嫁接到人源Fab支架上，利用重鏈異源二聚技術（例如SEED技術）組裝成雙特異性抗體。
     Octet®高通量篩選高親和力雙特異性抗體

Octet®基于生物層干涉技術（BLI），是被美國藥典認可的用于親和力檢測的標準方法。Octet®具有高通量和易使用等特點，成為生物醫(yī)藥企業(yè)必備工具之一。在Merck的這個方案中，Octet®被選擇作為抗體親和力檢測的主要方法。
  Octet® Red 96，用Anti-human Fc傳感器固化抗體，分別與EGFR（左圖），NKp30（中圖）進行結合解離檢測其親和力。然后通過連續(xù)結合兩個靶點，觀察抗體是否可以同時結合兩個抗原（右圖）。  
   iQue®高通量流式檢測細胞水平結合

科研人員使用iQue® 3高通量流式細胞儀評估細胞結合，并使用儀器配套智能軟件ForeCyt®進行分析。iQue®高通量流式具有檢測速度快，樣品耗量少等特點，是細胞水平高通量篩選的常用儀器。
  左圖為EGFR高表達的A431細胞與雙特異抗體結合：每孔測量800-1800個A431細胞。在兩個初始洗滌步驟后，將細胞和100 nM的bsAbs孵育，洗滌后加入熒光標記的Goat Anti-Human IgG和碘化丙啶（標記死細胞）。可見，bsAbs可以和A431細胞結合。
 
右圖為雙特異抗體與NKp30結合：檢測雙特異性抗體是否可以同時結合兩個靶點，在bsAb以100 nM的濃度與A431細胞孵育和洗滌后，與His標簽的NKp30孵育30分鐘。再將細胞與抗His抗體和碘化丙啶孵育�？梢�，bsAbs可以同時結合A431細胞和NKp30。
 
Incucyte®實時監(jiān)測殺傷效果

對于免疫細胞殺傷實驗，Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)可以在不移動細胞培養(yǎng)板的情況下，對細胞狀態(tài)進行實時熒光拍攝，不需要對細胞進行懸浮處理，并且具備高通量特性，可同時放置6塊96或384孔板。 A431細胞深紅色染料染色。將靶細胞以20 μL體積以2500個細胞/孔接種到384孔透明底部微量滴定板中，并孵育3小時。以不同的E：T比（即1:1，5:1，10:1和20:1）加入NK細胞，再加入不同濃度的BsAbs。用綠色凋亡染料進行死活細胞染色，然后在Incucyte®系統(tǒng)中進行實時在線測量24小時。計算紅綠疊加面積為裂解率。用西妥昔單抗觸發(fā)的最大裂解率或用30 μM星孢菌素培養(yǎng)的靶細胞進行normalization。
可見，活性最佳的幾個BsAbs顯示出nM級的EC50殺傷效果（A圖），接近于100%的最大殺傷率（B,C圖）
     賽多利斯生物分析部門始終致力于智能、可靠的高通量藥物表征及篩選方法的開發(fā)。無論在藥物研發(fā)還是在基礎研究中，生物分析三劍客—Octet®分子互作分析系統(tǒng)、iQue®高通量流式細胞儀和Incucyte®實時活細胞分析系統(tǒng)，都能夠分別從分子互作水平、細胞互作水平和細胞成像水平中提供更高效，更便捷的解決方案，讓大家在競爭激烈的市場中占有一席之地！
 
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-參考文獻-
1.Structural Basis of Broad HIV Neutralization by a Vaccine-Induced Cow Antibody. Sci Adv (2020) 6:eaba0468. doi: 10.1126/sciadv.aba0468

2.Grabbing the Bull by Both Horns: Bovine Ultralong CDR-H3 Paratopes Enable Engineering of 'Almost Natural' Common Light Chain Bispecific Antibodies Suitable For Effector Cell Redirection. Frontiers in Immunology, 01 Jan 2021, 12:801368