干細胞污染防控技術

在干細胞的基礎與應用研究飛速發(fā)展的今天, 干細胞的體外培養(yǎng)和實際應用中可能出現(xiàn)的安全問題越來越受關注。相對于干細胞內(nèi)源性污染，外源性污染防控更重要。本文介紹一種如何控制外源性污染的方法。
干細胞是一類具有高度自我更新和多向分化潛能的細胞, 是構成機體所有功能細胞的種子細胞 ,在體外適宜的培養(yǎng)條件下可以無限增殖, 進而分化為多種功能細胞及組織器官。當代科學家普遍認為, 人類干細胞的研究將為再生醫(yī)學提供廣闊的應用前景 。特別是在組
織工程學方面,干細胞被認為可以解決長期困擾臨床的器官不足和免疫排斥的難題, 從而實現(xiàn)人類用人工培養(yǎng)的組織和器官替代或更換疾病組織和器官的目標。

干細胞研究及其相關臨床應用在為人類帶來巨大利益的同時 ,也存在著生物危害的潛在安全隱患。例如 ,無論用于基礎研究還是臨床治療 ,都必須經(jīng)過實驗室干細胞分離 、培養(yǎng) 、定向誘導分化甚至基因操作, 體內(nèi)研究還涉及細胞的移植和體內(nèi)示蹤等較為復雜和耗時的過程 ,在干細胞實驗室操作中 ,存在來自干細胞的內(nèi)源性的和操作過程中外源性的生物危害風險。
一　內(nèi)源性污染
1　內(nèi)源性污染的來源
內(nèi)源性污染主要是從干細胞的來源來考慮的 。目前, 在干細胞的基礎研究和臨床治療研究中 ,首要來源是自體干細胞;其次是異體干細胞 ;此外 , 還有經(jīng)過特殊培養(yǎng)的動物來源的干細胞等 。所謂干細胞的內(nèi)源性污染,著重強調(diào)的是細胞自身所攜帶傳染性疾病以及遺傳性疾病的問題。
二 外源性污染
1　外源性污染的來源
外源性污染 ,通常是指外源性微生物污染 ,包括細菌、支原體 、真菌和病毒污染等。細菌感染較為多見的是大腸桿菌 、金黃色葡萄球菌、假單胞菌屬等 ;常見的支原體污染包括以下幾種:人源支原體通常由實驗人員帶入 (如口腔支原體 、人支原體、唾液支原體);動物來源的支原體通常經(jīng)牛血清帶入 (發(fā)酵支原體 、精氨酸支原體 、萊氏支原體 );豬鼻支原體(分離自豬)可能經(jīng)胰蛋白酶 (在分離 、消化細胞時使用)帶入。
外源性污染可能的途徑有:①細胞分離和處理過程。細胞在操作和儲存的過程中面臨著嚴峻的細菌和支原體污染威脅 。病毒污染有可能是細胞實驗中偶然帶入病毒 ,如利用病毒建立細胞系或者利用病毒誘導編碼目的蛋白基因的表達, 使用被病毒污染的生物制品如動物血清組分 、胰蛋白酶等,在操作過程被實驗人員攜帶病毒污染。 ②許多干細胞的長期培養(yǎng)需要動物 (如小鼠 )基質(zhì)細胞作為飼養(yǎng)細胞來支持生長 ,導致一些已知或未知的動物源性病原體污染 。多年的體外細胞培養(yǎng) 、骨髓細胞移植及組織器官移植等經(jīng)驗告訴我們, 微生物污染處處存在。因此 ,在細胞實驗中以及實驗前后 ,對微生物污染進行嚴格的檢測顯得尤為重要。
2.外源性污染的危害
與內(nèi)源性污染相比 ,外源性污染具有污染途徑多、防控更為復雜的特點 。所以, 是否能夠在每個環(huán)節(jié)嚴格把關,防止外源性污染的發(fā)生,保證干細胞的質(zhì)量 ,對于干細胞研究和臨床治療研究起著決定性作用 。如果外源性污染控制不力 ,除了加重病情 ,預期臨床治療失敗以外 ,污染的病毒如果整合到受體的 DNA內(nèi) ,甚至可能導致腫瘤的意外發(fā)生。
三 外源性污染的防控措施
相對于內(nèi)源性污染防控 ,外源性污染的防控更加重要，重在加強實驗室的操作規(guī)范。

1. 規(guī)范干細胞風險評估體系 　
為了完善干細胞操作的風險評估體系 , 首要任務是建立一個各種類型干細胞模型的操作分級標準 ，詳細備案分離、增殖 、分化各種來源干細胞的操作步驟和實驗方案, 這有助于對微生物污染的來源 (人、試劑、器材等 )進行判斷。
2. 建立系統(tǒng)的病原微生物檢測方法 　
細菌的檢測首先通過觀察細胞培養(yǎng)上清的顏色變化, 當發(fā)生細菌污染時 ,短期內(nèi)培養(yǎng)液顏色變黃 ,表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生 ,有時可出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象;其次在倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮,有時在細胞表面和周圍有大量細菌存在 ,細胞生長停止并有中毒表現(xiàn) ;也可通過培養(yǎng)液涂片染色檢查初步確定細菌種類 ;或者通過肉湯培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)予以鑒定 。
四．一種來自歐盟的干細胞實驗室控制方案
干細胞研究中的安全問題技術性很強, 也許我們永遠無法徹底消除其不同層面、不同來源的安全性隱患。從防控角度來講，外源性的污染要比內(nèi)源性的更加重要，那么有沒有一種有效防控外源性污染的方法呢？一種來自歐盟的實驗室方式，歐菲姆電源式過氧化氫空間干霧滅菌系統(tǒng)有效解決這一問題。
1. 設備原理
　 電源式干霧滅菌系統(tǒng)是使用電源帶動（無須使用壓縮空氣），利用文丘里原理高速吸入空氣，在噴頭內(nèi)給空氣足夠大的動能。讓氣體高速與消毒液碰撞產(chǎn)生直徑小于5微米的干霧顆粒。讓消毒液以干霧顆粒的形式彌散在需要滅菌的無菌潔凈區(qū)，從而達到徹底滅菌效果，可替代熏蒸。原理非常簡單，但是需要解決：瞬間提供空氣足夠高的動能讓顆粒達到均勻的3－5微米、散熱降噪、設備空間占用三大問題。而歐菲姆獨有的硼鈷合金自帶潤滑功能的器械噴頭設計，將干霧設備的功效擴大化的同時，極大的降低了空間占用，解決了散熱，降噪的問題。
2 干霧滅菌方案構成
諾福特效殺孢子劑 + 歐菲姆干霧滅菌設備
干霧滅菌方案可安全用于P2以上級別的：無菌實驗室、微生物室環(huán)境消毒滅菌。
諾福特效殺孢子劑的特點：
①殺菌效力廣譜高效：同時殺滅200多種微生物。30分鐘對黑色枯草芽孢、嗜熱脂肪芽孢桿菌均能穩(wěn)定達到6個對單位殺滅率。
②歐盟進口，無味、無毒，對人體、環(huán)境安全。歐盟醫(yī)療食品安全認證。
③驗證資料齊全：可提供殺菌效力驗證；殘留驗證；材料兼容性驗證三項驗證的詳細資料，可提供驗證模版。

3.歐菲姆干霧滅菌設備的特點
①全球領先的霧化技術。干霧微粒均勻達到3－5微米。面積完全覆蓋。殺菌時間超短，1.5-3個小時可完成整個滅菌流程，保證實驗室空間安全。
②體積小、重量輕（凈重5.8KG），可方便使用大空間潔凈區(qū)（多點布置），和小空間無菌室滅菌。電源連接，方便移動。

結論：干細胞實驗室，外源性的污染防控比內(nèi)源性污染更復雜，一種來自歐盟的技術，能有效減少外源風險。 建議在風險評估研究和技術革新的基礎上, 制定和完善我國干細胞和細胞研究生物安全管理的體系和法律法規(guī) ,有效保證我國干細胞研究與應用的健康發(fā)展。