利用iQue流式進行高通量小分子藥物研發(fā)

iQue® 高通量流式細胞儀通過高通量懸浮細胞篩選填補了這一空白。具備多通道、多參數(shù)的特點，可以快速、輕松地篩選 96、384或 1536 孔板的大型文庫。通過ForeCyt®高通量分析軟件自動生成豐富、海量的數(shù)據(jù)集，快速確定化合物的優(yōu)先級，加快推進藥物發(fā)現(xiàn)流程。下面通過5大應(yīng)用，一覽iQue®在小分子藥物研發(fā)中的風采吧！

小分子藥物發(fā)現(xiàn)

1    急性髓系白血病治療藥物開發(fā)

盡管60%-70%的急性髓系白血�。ˋML）患者在接受標準誘導(dǎo)治療后病情得到緩解，但大多數(shù)患者會在三年內(nèi)復(fù)發(fā)，五年的總生存率只有27%。因此，尋找新的AML治療策略是一種亟待滿足的醫(yī)療需求。近期的三項研究中都將iQue®整合到AML潛在治療藥物篩選的工作流程中。

蒙特利爾大學免疫學和癌癥研究所（IRIC）的科研人員發(fā)現(xiàn)Mubritinib（一種ERBB2抑制劑）具有很強的在體外和體內(nèi)抗AML的活性，可通過抑制泛醌依賴性電子傳遞鏈（ETC）復(fù)合物I的活性而發(fā)揮作用[1]。赫爾辛基大學分子醫(yī)學研究院的科研人員通過iQue®，同時對34個原始AML樣本中不同細胞群對7種藥物，及27種組合劑量的體外敏感度進行了評估（圖1-1）。結(jié)果表明，AML樣本中的不同細胞群對靶向治療藥物的敏感度存在差異 ^[2]。

圖1-1. 實驗設(shè)置簡要流程示意圖

隨后，他們使用iQue®建立了一種高通量流式細胞術(shù)，同時監(jiān)測71種抗腫瘤化合物對多個造血細胞群（表面抗原表達）的劑量反應(yīng)。通過對比健康細胞和腫瘤細胞（來自AML、多發(fā)性骨髓瘤或慢性淋巴細胞白血病患者）的藥物反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)健康細胞反應(yīng)能夠預(yù)測出相應(yīng)惡性細胞的反應(yīng)（圖1-2）^[3]。

圖1-2. iQue®在造血細胞免疫表型分析中的應(yīng)用及門控策略。使用7-AAD和Annexin-V分別對單核細胞的死細胞和凋亡細胞進行排除。根據(jù)其核心表面抗原的表達，檢測11個細胞亞群（造血干細胞（HSC/CD34+CD38-），普通祖細胞（CPC/CD34+CD38+）。

2    小分子化合物庫篩選

FOXP3+ Treg細胞在控制癌癥免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用，但是作為Treg細胞的主要調(diào)節(jié)因子，F(xiàn)OXP3在誘導(dǎo)的Treg細胞中的表達并不穩(wěn)定，F(xiàn)OXP3的調(diào)控表達及Treg細胞功能的分子靶點也尚不明確。而能夠調(diào)節(jié)FOXP3表達及其下游基因（如CTLA4）的藥物靶點具有穩(wěn)定Treg表型及功能的潛力。來自阿斯利康IMED生物技術(shù)部門的研究人員使用iQue®開發(fā)了一種自動化384孔板的高通量流式細胞術(shù)表型實驗，可用于測定人類Treg細胞中FOXP3和CTLA4的蛋白表達^[4]（圖2）。
 

圖2. 使用iQue®進行人類Treg細胞擴增、表征和表型篩選。(A）擴增的Treg細胞表達高水平的FOXP3和CTLA4；(B) 擴增的Treg細胞缺乏IL-2的產(chǎn)生；(C, D) 導(dǎo)致FOXP3 MFI增加或減少（C）和導(dǎo)致CTLA4 MFI增加（D）的代表性化合物的柱狀圖；(E）人類Treg細胞表型篩選簡要實驗流程，包括Treg細胞的分離、擴增、小分子化合物處理以及細胞活力、FOXP3和CTLA4表達。

3    蛋白激酶抑制劑化合物庫篩選

北卡羅來納大學藥理學院的研究人員使用iQue®篩選出了一個包含800多種蛋白激酶抑制劑的化合物庫，并確定了可在KRAS突變型胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細胞系中促進MYC癌蛋白穩(wěn)定或降解的化合物^[5]（圖3）。由于KRAS信號使MYC變得穩(wěn)定，進而促進PDAC的生長，因此深入了解這種穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)方式將有助于開發(fā)出治療極具挑戰(zhàn)性癌癥的療法。

圖3. MYC降解篩選優(yōu)化。(A）GPS-MYC篩選示意圖。(B）GPS-MYC細胞用vehicle（DMSO）單一處理，或用MG132或CHX處理6小時，并在iQue®上進行分析。數(shù)據(jù)來自于每個對照組的前兩孔和后兩孔，分別代表實驗開始（0分鐘）和結(jié)束（45分鐘）。(C) GPS-MYC篩查是一式兩份的。數(shù)據(jù)與對照組DMSO（藍色圓圈，0%穩(wěn)定）和MG132（綠色圓圈，100%穩(wěn)定）進行歸一化處理，并以兩個重復(fù)的30%平均穩(wěn)定率為界確定命中率。代表命中的圓圈以紫色顯示。圓圈的大小與每孔的事件數(shù)成正比。評估出的穩(wěn)定化化合物在圖中標出。(D) 與(C)相同，除了對照組為DMSO（藍色圓圈，0%失穩(wěn)）和CHX（紅色圓圈，100%失穩(wěn)）。評估出的不穩(wěn)定化合物被標出。

4   揭示小分子BH3模擬物抗癌機制

抑制癌細胞的抗凋亡機制也是一種極具前景的治療方法。小分子BH3模擬物能夠模擬BH3蛋白，抑制抗凋亡蛋白促細胞生存的功能，從而誘導(dǎo)癌細胞凋亡。要成為真正的BH3模擬物，就必須滿足2個標準：

1. 需要直接在已知抗凋亡依賴性細胞的線粒體上發(fā)揮作用；

2. 直接且選擇性抑制具有高親和力的抗凋亡蛋白。

來自美國丹娜法伯腫瘤醫(yī)院的科研人員開發(fā)了一套能夠綜合分析BH3模擬候選物，并進行高通量活性測試的方法。iQue®在此方法主要用于進行活性測試^[6]。
 

5   確定去鐵酮（DFP）的抗增殖機制

近期，佐治亞理工學院的一項研究中使用iQue®確定去鐵酮（DFP）的抗增殖機制[7]。DFP是2011年由FDA批準在美國上市的一種可口服的鐵螯合劑，與鐵具有良好的親和力，可有效地控制體內(nèi)鐵負荷。研究人員發(fā)現(xiàn)，DFP的抗增殖活性主要來自其對鐵依賴組蛋白賴氨酸脫甲基酶（KDM）亞群的抑制。他們還發(fā)現(xiàn)了基于DFP的新型KDM抑制劑，該抑制劑對癌細胞系的細胞毒性更強。在小鼠異種移植模型中，僅一種先導(dǎo)化合物就能有效抑制乳腺腫瘤的生長。在該研究中，所有基于流式細胞術(shù)的測試均由iQue®完成。

為什么iQue®在小分子藥物開發(fā)中被廣泛認可？
 

• 更快的高通量篩選：96孔板分析僅需5分鐘，384孔板分析僅需20分鐘；

• 節(jié)約成本，加快研發(fā)速度：每個孔中采樣 1 µL，節(jié)省了試劑成本，保存了有限的樣本；

• 為懸浮細胞的高通量篩選賦能：對免疫調(diào)節(jié)劑或復(fù)雜的混合細胞（如 PBMC）的分析進行優(yōu)化，并以單細胞的分辨率生成每種細胞類型的數(shù)據(jù)；

• 智能的數(shù)據(jù)分析處理：ForeCyt®軟件是基于微孔板整板分析的大型數(shù)據(jù)集，包括內(nèi)置標準曲線和獨特功能（如 Profile Map）的數(shù)據(jù)分析和可視化工具，數(shù)據(jù)可輕松導(dǎo)出到您的電子實驗室筆記本系統(tǒng)

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-參考文獻-

1. Baccelli I, Gareau Y, Lehnertz B, et al. Mubritinib as a strong in vitro and in vivo anti-leukemic compound, acting through ubiquinone-dependent inhibition of electron transport chain complex I (ETC1). http://dx.doi. org/10.1101/513887

2. Kuusanmäki H, Leppä A-M, Pölönen P, et al. Phenotypebased drug screening reveals association between venetoclax response and differentiation stage in acute myeloid leukemia. Haematologica. 2020:105(3):708-720. doi: 10.3324/haematol.2018.214882.

3. ntasir MM, Leppä A-M, Hellesoy M, et al. Multiparametric single cell evaluation defines distinct drug responses in healthy hematological cells that are retained in corresponding malignant cell types. Haematologica. 2020;105(6):1527-1538. doi:10.3324/haematol.2019.217414.

4. Ding M, Brengdahl J, Lindqvist M, et al. A Phenotypic Screening Approach Using Human Treg Cells Identified Regulators of Forkhead Box p3 Expression. ACS Chem Biol. 2019;14(3):543-553. doi: 10.1021/acschembio.9b00075. Epub 2019 Mar 4. PMID: 30807094

5. Blake, DR, Vaseva AV, Hodge RG, et al. Application of a MYC degradation screen identifies sensitivity to CDK9 inhibitors in KRAS-mutant pancreatic cancer. Sci Signal. 2019;12(590):eaav7259. Doi: 10.1126/scisignal.aav7259.

6. Villalobos-Ortiz M, Ryan J, Mashaka TN, et al. BH3 profiling discriminates on-target small molecule BH3 mimetics from putative mimetics. Cell Death Differ. 2020;27(3):999-1007. doi:10.1038/s41418-019-0391-9.

7. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, et al. Deferiprone: pan-selective histone lysine demethylase inhibition activity and structure activity relationship study. Sci Rep. 2019;9(1):4802. doi:10.1038/s41598-019-39214-1.