Ampha Z32花粉活力分析儀的應(yīng)用：耐熱辣椒品種評(píng)估及篩選

辣椒是重要的香料和蔬菜作物，在全球氣候變暖的背景下，高溫脅迫已成為辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的主要限制因素，尤其是在熱帶和亞熱帶地區(qū)，因此培育耐熱品種對(duì)于辣椒的持續(xù)生產(chǎn)至關(guān)重要。在辣椒等果實(shí)作物中，生殖發(fā)育尤其是花粉發(fā)育過(guò)程，對(duì)高溫脅迫最為敏感，可作為耐熱品種選育的指標(biāo)。花粉活力和花粉萌發(fā)率通常主要通過(guò)染色法和顯微鏡檢鏡檢來(lái)評(píng)估，這兩種方法均操作繁瑣、通量低且結(jié)果誤差大，限制了其在育種中的應(yīng)用。已有研究表明，Ampha Z32花粉活力分析儀（IFC，微流控阻抗流式細(xì)胞儀）是一種高效、非標(biāo)記、可靠的單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)，能夠以獨(dú)立于物種以高通量方式分析花粉活性。在本項(xiàng)研究中，科研人員利用Ampha Z32花粉活力分析儀針對(duì)21 個(gè)辣椒品種進(jìn)行了三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，從而確定了IFC法在評(píng)估辣椒花粉性狀耐熱性的有效性。
● 確定辣椒花粉性狀（活性、濃度）評(píng)估的最佳時(shí)期；
● 評(píng)估不同品種辣椒花粉性狀對(duì)不同熱處理的響應(yīng)，確定耐熱性品種篩選的有效熱處理溫度；
● 染色法（花粉活力）、萌發(fā)法（花粉萌發(fā)率）驗(yàn)證IFC 法的（花粉活性）有效性，確定導(dǎo)致花粉性狀差異性的最主要影響因素并篩選出耐熱品種。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， IFC法是一種評(píng)估辣椒花粉性狀的高效且準(zhǔn)確的方法。本次實(shí)驗(yàn)為該領(lǐng)域的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)，可更有效地支持到耐熱品種的選育中。

Ampha Z32花粉活力分析儀簡(jiǎn)介
 

A）細(xì)胞在不同頻率的交流電場(chǎng)中的檢測(cè)結(jié)果，低頻下反映細(xì)胞的體積特性，高頻下反映細(xì)胞膜的介電特性即細(xì)胞活性；B) 微流控芯片；C）流經(jīng)交流電場(chǎng)的細(xì)胞的阻抗信號(hào)（藍(lán)色實(shí)部即電阻信號(hào)，綠色虛部即容性電抗信號(hào)），細(xì)胞膜完整性決定容性電抗的大小，故可通過(guò)虛部信號(hào)來(lái)區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞，最終以阻抗相位角-振幅散點(diǎn)圖反映出來(lái)

Ampha Z32花粉活力分析儀細(xì)胞儀（瑞士Amphasys AG），通過(guò)檢測(cè)流經(jīng)交流電場(chǎng)的細(xì)胞懸浮液中細(xì)胞的電阻抗信號(hào)，分析獲得細(xì)胞的數(shù)量、大小、活性。該儀器可以在0.3-30MHz的范圍內(nèi)同時(shí)測(cè)量4個(gè)不同頻率下細(xì)胞的電阻抗特性，適配微流控芯片通道尺寸范圍為15-400μm（圖1B），可滿足0-300μm范圍內(nèi)的任意生物、非生物單細(xì)胞的活性測(cè)量。

電場(chǎng)中活細(xì)胞的等效電路由電阻（細(xì)胞質(zhì)）和電容（細(xì)胞膜）組成，在笛卡爾坐標(biāo)系中，阻抗Z（ω）可以描述為實(shí)部分Zr（ω）或電阻與虛部分Zi（ω）或容性電抗的矢量和。

相位角（θ）描述電阻和電抗之間的關(guān)系：
阻抗指數(shù)即振幅表示為：
     

 

 
● 確定辣椒花粉性狀評(píng)估的最佳時(shí)期

ST1：尚未著色的未成熟小花蕾；ST2：花瓣幾乎完全著色的較大未成熟花蕾；ST3：完全著色的成熟花蕾；ST4：可見(jiàn)少量花粉的開(kāi)放花朵；ST5：可見(jiàn)較大量花粉的開(kāi)放花朵；ST6：花粉量豐富的完全開(kāi)放花朵；ST7：變色(棕褐色或黃色)的花朵。

表1 辣椒花粉七個(gè)發(fā)育階段的花粉濃度和花粉活性

注：HSD檢驗(yàn)中，同列中數(shù)據(jù)帶有相同小寫(xiě)字母表明組間在α=0.05水平下無(wú)顯著差異

本實(shí)驗(yàn)利用Ampha Z32花粉活力分析儀通過(guò)評(píng)估兩個(gè)辣椒品種在七個(gè)花粉發(fā)育階段的花粉濃度和花粉活力來(lái)確定花粉性狀評(píng)估的最佳時(shí)期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，開(kāi)花時(shí)期是造成花粉濃度和花粉活性差異的主要原因，此外花粉活性還受品種影響。如表1所示，平均花粉濃度為8889粒/ml，其中ST5期花粉濃度最高，ST4期次之，ST2期花粉濃度最低；平均花粉活性為52%，活性最高的是ST3 期(79.3%)、ST2期 (71.4%) 和 ST1期 (69.7%)，其次是 ST4期(53.3%) 和 ST5期 (52.2%)，開(kāi)花末期即ST7的花粉活性最低，僅為14.7%。品種9852-123的花粉活性（71%）顯著高于品種AVPP9823（33%）（圖2）。

 

● 確定耐熱辣椒品種篩選有效熱處理溫度

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)評(píng)估5個(gè)辣椒品種在5個(gè)熱處理下（41、44、47、50 及 55°C）和對(duì)照組的花粉性狀差異，確定了篩選耐熱性辣椒品種的有效熱處理溫度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱處理對(duì)花粉活性的影響顯著（P<0.001）；熱處理和品種的綜合效應(yīng)顯著影響花粉濃度（P<0.001）。熱處理下的平均花粉活性為72%，其中44℃（83%）和47℃（82%）處理下的花粉活性與對(duì)照組（88%）無(wú)明顯差異，41℃（82%）的花粉活性略低于對(duì)照組，50℃（69%），55℃（27%）處理下的花粉活性最低（表2）。熱處理下的平均花粉濃度為13622粒/ml，其中花粉濃度最高的是55℃熱處理下的品種AVPP1704，其次在 47°C處理下的 AVPP1708，而41 ℃和50°C 熱處理下的品種 1607-7031-1 和在50°C 熱處理下 AVPP1704花粉濃度最低（表3）。

表2 5個(gè)辣椒品種的對(duì)照組和5個(gè)熱處理溫度下的平均花粉活性(%)

表3 5個(gè)辣椒品種的對(duì)照組和5個(gè)熱處理溫度下的平均花粉濃度

● 驗(yàn)證IFC法檢測(cè)花粉活性的有效性

本實(shí)驗(yàn)于4月（較冷月）和6月（較熱月）分別利用Ampha Z32花粉活力分析儀、染色法和萌發(fā)法評(píng)估了21個(gè)辣椒品種在未經(jīng)處理和45℃或50℃處理下的花粉活性（IFC法）、花粉濃度、花粉活力（染色法）、花粉萌發(fā)率（萌發(fā)法）和花粉管長(zhǎng)度（萌發(fā)法），以驗(yàn)證IFC法在檢測(cè)花粉活性的有效性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同月份下，處于不同處理?xiàng)l件的不同品種的花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度差異顯著；不同月份下的不同處理間及不同月份下的不同品種間的花粉濃度和花粉活力均差異顯著；而不同月份下的不同品種間及不同月份下的不同品種在不同處理下的花粉活性差異顯著。由此可見(jiàn)，月份是造成花粉活性（MS=9.3）、花粉濃度（1.1×）、花粉萌發(fā)（MS=112.4）和花粉活力（MS=0.6）差異的最主要影響因子，而熱處理是造成花粉管長(zhǎng)度差異的最主要影響因子（MS=40764）。

 

 

 

 

 

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用染色法驗(yàn)證了IFC法在檢測(cè)花粉活性中的有效性，結(jié)果表明花粉活力（染色法）和花粉活性（IFC法）之間存在顯著（P=0.0001）正相關(guān)（=0.53）（圖11）。

 

● 結(jié)論

精準(zhǔn)篩選是成功培育特定性狀的首要條件之一。耐熱性是由幾個(gè)性狀組成的復(fù)雜表型，辣椒等結(jié)果型作物最主要的耐熱性性狀涉及生殖組織，尤其是花粉。而傳統(tǒng)上通常使用染色鏡檢來(lái)評(píng)估花粉活力，這些方法普遍統(tǒng)計(jì)性有限（花粉粒≈100），且檢測(cè)策略繁瑣耗時(shí)，且可能不準(zhǔn)確。為了克服這些局限性，Heidmann等人（2016年）提出使用IFC篩選辣椒和其他作物在高溫脅迫下的花粉發(fā)育過(guò)程和花粉活力，本次研究進(jìn)一步確認(rèn)IFC評(píng)估辣椒花粉的適用性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， IFC可以區(qū)分可萌發(fā)的活花粉（活性花粉）、不能萌發(fā)的活花粉（非活性花粉）和無(wú)活力的花粉，其中幼齡花粉（第 1 和第 2 階段）和開(kāi)花前的花粉（第3 階段）具有較高比例的活性花粉，然而花粉濃度（從花藥開(kāi)裂的花粉）在第 2 階段最低，在開(kāi)花前后更高（表 1）。由IFC法可確定評(píng)估辣椒花粉耐熱性的臨界溫度是 50°C，高于 47°C 的所有溫度下，花粉活性都顯著下降，其中55°C的花粉活性最低，這與Heidmann等人（2016年）的研究結(jié)果一致。熱處理和品種的相互作用下導(dǎo)致花粉濃度的差異，這與此前野生和栽培番茄、不同豆類(lèi)品種以及榛子品種的研究結(jié)果一致。已有研究證實(shí)，高溫會(huì)導(dǎo)致花粉活力下降，辣椒在坐果期間，氣溫在18到32°C之間時(shí)產(chǎn)量會(huì)更高。生長(zhǎng)月份是導(dǎo)致本次研究中除花粉管長(zhǎng)度外的其他性狀差異性的主要因素，本次實(shí)驗(yàn)的4月份，除上午11:00到下午4:00間的溫度超過(guò)32°C，其他時(shí)間的溫度均在辣椒的最佳生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)，而6月溫度從上午8:00起就超過(guò)32°C，直到下午6:00之后才下降，4月的最佳生長(zhǎng)條件顯然有助于提高這些品種中幾乎所有性狀的表現(xiàn)，但此期間的熱處理在區(qū)分耐熱和熱敏性品種方面仍然非常有效，本次研究篩選出PBC 507 和 PBC 831兩個(gè)耐熱性品種。染色法的花粉活力和使用 IFC法 的花粉活性結(jié)果顯著正相關(guān)性，表明IFC適用于熱脅迫條件下評(píng)估辣椒花粉的質(zhì)量。

總之，IFC法是一種檢測(cè)快速、操作簡(jiǎn)單、通量且準(zhǔn)確性高的檢測(cè)方法，可應(yīng)用于育種方案中評(píng)估大量種質(zhì)資源和耐熱性表型性狀的篩選。

—— 原文閱讀 ——
S Lin, T Lin, CKMYee, J Chen, et al. Impedance Flow Cytometry for Selection of Pollen Traits UnderHigh Temperature Stress in Pepper. HortScience. 57(2) : 181-190. 2022

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小滿者，物至于此小得盈滿。