Olympus SpinSR應用：STTT 揭示狼瘡腦損傷機制研究新進展

     Make it EVIDENT     

本期推出【SpinSR Makes Synapse Evident】

 

南京大學附屬鼓樓醫(yī)院/南京中醫(yī)藥大學 

孫凌云/胡剛團隊

 

補體信號與神經(jīng)精神狼瘡

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種難以治愈的自身免疫性疾病，40-90% 的患者會出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀，表現(xiàn)為焦慮、抑郁和認知障礙等，稱為神經(jīng)精神狼瘡（NPSLE）。

既往觀念認為NPSLE是系統(tǒng)性免疫持續(xù)激活累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的后果，然而，針對這些認識的治療（免疫抑制劑及激素）并不能遏制病情進展，長期使用還易產(chǎn)生多種不良反應。研究表明，神經(jīng)癥狀多出現(xiàn)在SLE病程早期，提示腦內早發(fā)致病因素的存在。靶向這些因素的發(fā)現(xiàn)，是深化疾病認知和治療學突破的關鍵。

補體蛋白C1q是經(jīng)典補體信號的啟動因子。最近研究發(fā)現(xiàn)腦內C1q具有獨特的生物學功能，可以調控小膠質細胞對神經(jīng)突觸的修剪，對神經(jīng)環(huán)路的精準發(fā)育及衰老、阿爾茨海默病、精神分裂癥等病變過程中的突觸丟失至關重要。但對于其在NPSLE中的效應，仍然知之甚少。

神經(jīng)元-補體-小膠質細胞突觸修剪調控神經(jīng)精神狼瘡

2022年2月18日，南京大學孫凌云教授與南京中醫(yī)藥大學胡剛教授團隊合作，在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF=38.104）上以長文形式發(fā)表題為Neuronal NR4A1 deficiency drives complement-coordinated synaptic stripping by microglia in a mouse model of lupus的研究論文，提出神經(jīng)突觸丟失是NPSLE早期腦內病理，其機理系通過神經(jīng)元Nr4a1-C1q-小膠質細胞協(xié)同調控的突觸修剪。

 

研究團隊首先利用自發(fā)狼瘡的MRL/lpr小鼠模型，利用綜合行為學分析系統(tǒng)進行動態(tài)評估，發(fā)現(xiàn)改模型小鼠在狼瘡病程早期（系統(tǒng)性病理改變及腎臟損傷之前）就已出現(xiàn)顯著的焦慮行為。同時模型小鼠海馬和皮層的小膠質細胞激活。這一發(fā)現(xiàn)提示腦損傷發(fā)生在狼瘡病程的早期，腦內小膠細胞激活可能參與狼瘡腦損傷的病理進程。

 

MRL/lpr小鼠早期（6周齡）時出現(xiàn)焦慮行為（上圖）

伴海馬小膠質細胞激活（下圖）

 

為了明確模型小鼠出現(xiàn)焦慮行為時腦內病理改變的分子機制，研究團隊對小鼠海馬組織進行RNA測序。作者發(fā)現(xiàn)，MRL/lpr小鼠海馬小膠質吞噬基因激活，伴隨補體信號上調，同時神經(jīng)突觸傳遞、LTP信號被抑制。

 

MRL/lpr小鼠海馬屯膠質吞噬信號、補體信號激活，突觸傳遞、LTP信號抑制

 

為了進一步確定小膠質細胞吞噬激活、突觸功能異常在NPSLE中的作用，作者通過超分辨顯微成像，發(fā)現(xiàn)模型小鼠海馬突觸蛋白（SYN,突觸前膜; PSD-95,突觸后膜）熒光密度顯著減少。STED顯微鏡結合Imaris分析顯示，活化的小膠質細胞吞噬神經(jīng)突觸增多。進一步利用藥理學方法抑制小膠質細胞吞噬功能，可以顯著緩解MRL/lpr小鼠海馬突觸丟失及焦慮行為。

 

MRL/lpr小鼠海馬突觸蛋白熒光信號顯著減少（上圖）

（使用Olympus SpinSR活細胞超分辨轉盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝）

 

為了進一步明確C1q在小膠質細胞突觸吞噬中的作用，研究團隊首先通過顯微成像研究發(fā)現(xiàn)小鼠海馬升高的C1q多定位于突觸末端。作者進一步利用中和抗體特異性阻斷小鼠海馬C1q信號，發(fā)現(xiàn)C1q阻斷可緩解狼瘡小鼠的神經(jīng)損傷。提示小膠質細胞突觸修剪和C1q信號共同參與NPSLE的發(fā)病。

 

C1q主要定位于突觸末梢，利用中和抗體阻斷腦內C1q信號可以緩解狼瘡小鼠的神經(jīng)損傷

 

除了小膠質細胞修剪外，突觸結構或神經(jīng)元內在電活性的改變也參與突觸密度的調節(jié)。但對于神經(jīng)元如何與小膠質細胞溝通并協(xié)同調控突觸丟失，仍然知之甚少。

 

接下來，研究團隊對突觸修剪的神經(jīng)元調控機制進行了探究。通過對MRL/Lpr小鼠海馬組織轉錄組測序，篩選出了潛在效應信號分子-Nr4a1。

 

有趣的是，抑制神經(jīng)元的興奮性可以減少Nr4a1的表達，與文獻報道的降低的神經(jīng)元電活性促進小膠質細胞突觸修剪的理論一致，支持Nr4a1參與狼瘡腦內突觸吞噬的作用。為了確認Nr4a1的具體調控機制，團隊制備了神經(jīng)元-小膠質細胞共培養(yǎng)模型，并利用敲減慢病毒在原代神經(jīng)元中干擾Nr4a1表達，明確神經(jīng)元Nr4a1信號減弱導致突觸骨架蛋白異常，作為橋梁信號促進C1q的突觸定位，并被活化的小膠質細胞識別吞噬。

 

在原代神經(jīng)元中敲減Nr4a1科減少C1q的突觸定位

 

下一步，團隊對Nr4a1調控狼瘡腦損傷的體內作用進行了探究。團隊利用先前確定的海馬立體定位注射技術和過表達慢病毒，在模型小鼠海馬神經(jīng)元中過表達Nr4a1。

 

利用這一方法，團隊證明了海馬神經(jīng)元Nr4a1是調控C1q定位及小膠質細胞定向突觸修剪介導NPSLE發(fā)病的關鍵信號。

 

海馬神經(jīng)元特異性過表達Nr4a1緩解狼瘡腦損傷

（突觸熒光信號圖 使用Olympus SpinSR活細胞超分辨轉盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝）

 

因此，該研究應用多種模型及研究方法，闡明了突觸丟失是狼瘡腦損傷的早期病理，小膠質細胞、補體信號、神經(jīng)元共同參與該過程。

 

同時，該工作首次揭示神經(jīng)元內在Nr4a1異常在調控C1q-小膠質細胞“突觸修剪”中的主動作用。為狼瘡腦損傷及相關疾病的早期干預提供了新策略及新靶點。

 

Nr4a1-C1q-microglia 調控突觸修剪參與NPSLE發(fā)病機制的示意圖

 

在本次研究中，小鼠海馬突觸蛋白熒光標記圖片使用了Olympus SpinSR活細胞超分辨轉盤共聚焦顯微成像系統(tǒng)拍攝，該系統(tǒng)無需特殊標記手段即可實現(xiàn)低至110nm的XY分辨率，成像速度可達200pfs，適合進行快速圖像拼接及低光毒性延時成像，更有利于在較大的范圍內觀察標本或者對活體樣品進行長時間觀察。在此，感謝Evident江蘇省代理商 南京奧力科學儀器有限公司市場部 毛雨 對實驗的大力支持。