生物反應(yīng)器應(yīng)用：人間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC培養(yǎng)及放大過程工藝關(guān)鍵
人間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）在治療神經(jīng)、骨骼、關(guān)節(jié)和心血管等疾病上顯示出了良好的發(fā)展前景。異源hMSC由于其低免疫排斥性和低制造成本顯示出了更大的發(fā)展?jié)摿�。臨床試驗(yàn)中，治療效果很大程度上取決于給患者輸入的合格細(xì)胞數(shù)量。因此，體外擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞、降低生產(chǎn)成本，以及擴(kuò)增系統(tǒng)的持續(xù)穩(wěn)定性將是未來細(xì)胞治療商業(yè)化的關(guān)鍵。
工業(yè)研究表明，與傳統(tǒng)平面擴(kuò)增方法相比，使用微載體生物反應(yīng)器培養(yǎng)可以獲得近80倍的單位體積細(xì)胞產(chǎn)量，同時所占空間更少從而降低了整體制造成本。在生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)具有易于擴(kuò)展、更均勻的營養(yǎng)分布、可以實(shí)現(xiàn)在線/離線監(jiān)測、可以實(shí)施多種補(bǔ)料策略等優(yōu)勢。同時還可以更好地滿足FDA對實(shí)施過程分析技術(shù)（PAT）的建議。
與平面擴(kuò)增方法不同，微載體培養(yǎng)需要攪拌使培養(yǎng)基均質(zhì)化，氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞代謝物交換也需依賴傳質(zhì)完成。攪拌還會帶來剪切力，也將影響細(xì)胞的生長。同時，由于細(xì)胞附著微載體主要靠細(xì)胞和微載體之間的碰撞和粘附，這一過程也將比平面培養(yǎng)耗時更久。Bioprocessing of Human Mesenchymal Stem Cells: From Planar Culture to Microcarrier-Based Bioreactors中討論了微載體hMSC擴(kuò)增中生物反應(yīng)器的重要過程參數(shù)，如溫度、pH、DO、攪拌和進(jìn)料策略，以滿足更復(fù)雜的生物過程需求。
攪拌
生物反應(yīng)器攪拌速率保持在所需的速度下限，可以在滿足傳質(zhì)需求的條件下避免微載體在死區(qū)的聚集。保持微載體懸浮的攪拌速度下限可以通過可視化或粒子圖像測速進(jìn)行確定。找到完全懸浮所有微載體的閾值攪拌，同時要確保微載體均勻分散。
此外在利用微載體進(jìn)行生物反應(yīng)器大規(guī)模擴(kuò)增時還需考慮體積能量耗散的影響，即微載體懸浮所需的單位體積功率輸入與攪拌速度成正比。攪拌速度常需要隨著培養(yǎng)時間的增加而增加，以抵消較重微載體造成的聚集。與混合相關(guān)的另一個因素是葉輪尖端速度。由于葉輪尖端剪切應(yīng)力高，對細(xì)胞造成的潛在損害也是較大的。因此，選擇合適的葉輪的尺寸和幾何形狀對可行性至關(guān)重要。
適于細(xì)胞培養(yǎng)的反應(yīng)器槳葉控制系統(tǒng)（溫度、pH和DO）
hMSC培養(yǎng)適宜溫度通常為37°C。生物反應(yīng)器通常配備有溫度控制單元，該溫度控制單元接收來自溫度傳感器的信號。在生物反應(yīng)器培養(yǎng)中有兩種調(diào)節(jié)溫度的方法。一種是保持生物反應(yīng)器水套的溫度；另一種是通過熱電偶或溫度傳感器測量溫度來直接控制并使用加熱毯或墊加熱生物反應(yīng)器。前者可能由于間接測量而有一些偏差，而后者需要關(guān)注溫度傳感器和熱源的相對位置。
高細(xì)胞密度的微載體培養(yǎng)需要對pH值進(jìn)行更精細(xì)的控制，這對軟件PID控制功能提出了要求。pH設(shè)定值通常介于7至7.5之間，可通過稀釋堿（例如，NaOH、NaHCO3）和稀釋酸（例如，H2SO4）或CO2氣體來控制pH值。盡管生物反應(yīng)器每次使用前必須校準(zhǔn)在線pH電極，但結(jié)合離線校準(zhǔn)可提高細(xì)胞增殖期間的測量精度。
D2MS多參數(shù)設(shè)置與視頻流監(jiān)控軟件界面
溶解氧（DO）是維持代謝活動和細(xì)胞生長的重要因素。生物反應(yīng)器供氧有兩種方式：底通（sparger)和表通(overlay)。與微生物發(fā)酵相比，hMSC培養(yǎng)過程中的溶解氧通常可以通過表通(overlay)曝氣來保持。但當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到某一臨界值，并氣液表面與體積比太低，則可以考慮底通（sparger)曝氣供氧。
D2MS過程數(shù)據(jù)監(jiān)測軟件界面
氧傳質(zhì)速率，表示生物反應(yīng)器中氧傳質(zhì)的效率，由界面面積、傳質(zhì)系數(shù)和氧濃度梯度決定。界面面積由幾何參數(shù)決定，包括生物反應(yīng)器的形狀、尺寸以及噴射氣泡的大小決定。氣泡尺寸越小，界面面積越大，氧傳遞越好。氧傳質(zhì)系數(shù)受混合、能量耗散等因素的影響。有研究表明，在氣流速率為0.05vvm的2-L生物反應(yīng)器中，將攪拌速度從6 rpm增加到20rpm時，氧傳質(zhì)系數(shù)（kLa）增加了1.7倍。
補(bǔ)料策略
培養(yǎng)基是hMSC生產(chǎn)的主要成本之一。采用合理的補(bǔ)料策略，有利于用更少體積的培養(yǎng)基收獲更大的細(xì)胞產(chǎn)量。分批培養(yǎng)是一種方便且經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)策略。其優(yōu)點(diǎn)有易于操作、低污染風(fēng)險和更少的培養(yǎng)基用量。但由于營養(yǎng)的限制，分批培養(yǎng)無法實(shí)現(xiàn)高細(xì)胞密度培養(yǎng)。
更常見的培養(yǎng)策略是分批補(bǔ)料式培養(yǎng)，可以避免營養(yǎng)消耗帶來的生長抑制，中途無需停止攪拌，還保留了hMSC分泌的細(xì)胞因子，并且在擴(kuò)增過程中沒有細(xì)胞丟失。但這種培養(yǎng)策略由于環(huán)境改變，可能會導(dǎo)致單位體積細(xì)胞產(chǎn)量減少。
灌流培養(yǎng)策略可以穩(wěn)定地將新鮮培養(yǎng)基添加到生物反應(yīng)器中，同時將用過的培養(yǎng)基泵出。這種策略可以獲得單位培養(yǎng)基體積下更大的細(xì)胞密度。有研究在基于微載體的攪拌罐生物反應(yīng)器中使用相同培養(yǎng)基，用分批補(bǔ)料和灌流培養(yǎng)策略進(jìn)行培養(yǎng)。灌流培養(yǎng)得到的細(xì)胞密度是分批補(bǔ)料的1.28倍。灌注培養(yǎng)補(bǔ)料速率可根據(jù)生長和離線培養(yǎng)基分析進(jìn)行控制，可以以更少的培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)料。
參考文獻(xiàn)：Tsai AC, Pacak CA. Bioprocessing of Human Mesenchymal Stem Cells: From Planar Culture to Microcarrier-Based Bioreactors. Bioengineering (Basel). 2021 Jul 7;8(7):96. doi: 10.3390/bioengineering8070096. PMID: 34356203; PMCID: PMC8301102.
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