雙光子鈣成像應(yīng)用：海馬星形膠質(zhì)細胞編碼獎賞位置研究

復旦大學腦科學轉(zhuǎn)化研究院 

小毛驢會一直追著胡蘿卜跑嗎？

有這么一則小故事，主人為了讓驢一直跑，就用桿子挑著一根胡蘿卜，吊在驢的面前，驢為了吃到胡蘿卜就不停地向前走，走啊，走啊...

當然，這只是一個故事。有人拿一頭真正的毛驢做了實驗，吊著一根胡蘿卜領(lǐng)著毛驢走，毛驢確實向胡蘿卜所在的方向走了幾步，但是當發(fā)現(xiàn)吃不到胡蘿卜時就走開了。

這里面涉及了一個有趣的獎勵記憶的機制。過去胡蘿卜擺在前面，驢只要向前走就能吃到，于是當驢看到胡蘿卜時，就會向前走，當前進這一行為無法縮短與胡蘿卜的距離，與過去對獎勵的記憶相違背時，這種對獎勵的記憶就會消失。

【海馬體/獎勵記憶】

海馬體被認為在新記憶的形成中起著關(guān)鍵作用，獎勵記憶就包含其中。獎勵記憶的研究大多使用小鼠，一般讓小鼠渴幾天，隨后讓小鼠進行某種重復活動，在某一位置給小鼠水獎勵，進行獎勵位置的記憶訓練。

1971年J.O'Keefe和J.Dostrovsky發(fā)表在Brain Res上的研究表明，小鼠海馬體神經(jīng)元的活動在靠近獎勵位置的區(qū)域時會有明顯上升^[1]。2018年Jeffrey L Gauthier和David W Tank發(fā)表在Neuron上的研究表明，小鼠海馬體CA1區(qū)的神經(jīng)元在獎勵位置附近活躍^[2]。2022年Adi Doron等研究了小鼠海馬體CA1區(qū)的星形膠質(zhì)細胞在獎勵記憶中的作用，研究成果發(fā)表在了Nature上^[3]。

圖1：虛擬現(xiàn)實期間對小鼠CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞進行雙光子鈣成像[3]

 

【活體雙光子鈣成像】

將病毒AAV5-gfaABC1D-cyto-GCaMP6f注射進小鼠海馬體CA1區(qū)中（使用病毒載體AAV5，以星形膠質(zhì)細胞特異性gfaABC1D為啟動子，在CA1區(qū)的星形膠質(zhì)細胞中特異性表達胞質(zhì)靶向鈣指示劑cyto-GCaMP6f），由于海馬體距離小鼠大腦表面超過了雙光子成像的最大深度（最大深度1mm），于是選擇在錐體細胞層上方100 µm處放置成像窗口，用雙光子顯微鏡對CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞進行長期鈣成像。

將雙光子鈣成像與定制的圓形虛擬現(xiàn)實（VR）設(shè)備相結(jié)合，訓練頭部固定的小鼠在跑步機皮帶（皮帶長度170 cm）上跑步，完成每圈 170 cm后給予一次水獎勵，與虛擬環(huán)境中的特定位置相匹配。訓練過的小鼠在4分鐘內(nèi)可以完成15圈跑動。

為了增加每段時間成像的星形膠質(zhì)細胞ROI（regions of interest）的數(shù)量，使用聚焦于CA1區(qū)不同深度的電動快速可調(diào)焦透鏡，在兩個不同的FOV（fields of view）中對CA1星形膠質(zhì)細胞進行雙光子鈣成像。

視頻2：兩個CA1區(qū)視場中的星形膠質(zhì)細胞鈣活動[3]

每個FOV中的成像結(jié)果以每秒7.745幀的速度采集，并在運動校正后顯示，單個星形膠質(zhì)細胞ROI在每個FOV中半自動分割獲得。從而獲得兩個FOV中，單個星形膠質(zhì)細胞在一段時間內(nèi)的鈣活動變化，提取來自每個ROI的信號后，計算Δ F/F，得出圖1f。

圖2：海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞對獎勵位置有記憶[3]

 

【海馬星形膠質(zhì)細胞編碼獎賞位置】

小鼠星形膠質(zhì)細胞可以對獎勵位置形成記憶嗎？左圖不同的顏色代表小鼠在跑道上不同的位置，星號代表水獎勵交付。隨著小鼠向獎勵位置的靠近，CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞活動事件增加。右圖每一條線代表一只小鼠，海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞的同步鈣活動隨著向獎勵位置靠近而升高，出現(xiàn)了明顯向獎勵位置的傾斜。這種傾斜說明海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞對獎勵位置產(chǎn)生了記憶。

圖3：獎勵位置不是實際的位置，而是獎勵的屬性[3]

獎勵位置是獎勵的屬性還是實際的位置呢？當獎勵在沿跑道的隨機位置給予時，小鼠海馬CA1區(qū)星形膠質(zhì)細胞的同步鈣活動向獎勵位置的傾斜消失。當小鼠跑到第11圈時，在相同環(huán)境中的新位置給予獎勵，傾斜消失，重新訓練一段時間后，傾斜出現(xiàn)了恢復。兩個實驗均表明星形膠質(zhì)細胞編碼的位置不是實際位置，而是獎勵的一種屬性。

圖4：對獎勵位置的記憶依賴于熟悉的環(huán)境[3]

小鼠星形膠質(zhì)細胞靠什么記憶獎勵位置，是周圍的環(huán)境嗎？跑步機皮帶提供觸覺提示，虛擬現(xiàn)實顯示器提供視覺提示。小鼠在特定觸覺提示與視覺提示的組合中接受了一段時間的訓練，這一組合被稱為熟悉環(huán)境，改變觸覺提示與視覺提示，形成新環(huán)境。星形膠質(zhì)細胞活動在熟悉的環(huán)境中表現(xiàn)出向獎勵位置的傾斜，但在新環(huán)境中卻沒有。在新環(huán)境中重新訓練一段時間后，傾斜出現(xiàn)恢復。說明小鼠對獎勵位置的記憶依賴于熟悉的環(huán)境。

圖5：星形膠質(zhì)細胞可以靠觸覺記憶獎勵位置[3]

此處的熟悉環(huán)境包括視覺線索和觸覺線索，星形膠質(zhì)細胞靠哪種感官記憶獎勵位置？在熟悉的環(huán)境中訓練小鼠，在成像過程中關(guān)閉虛擬現(xiàn)實顯示器，視覺線索消失，水獎勵在相同的位置給予。傾斜依舊存在，說明星形膠質(zhì)細胞可以靠觸覺記憶獎勵位置。

圖6：在熟悉環(huán)境中可以通過星形膠質(zhì)細胞鈣活動解碼小鼠位置[3]

能從星形膠質(zhì)細胞鈣活動解碼小鼠位置嗎？在熟悉環(huán)境中，解碼的預期小鼠位置與小鼠的實際位置基本符合，在新環(huán)境中，解碼的預期小鼠位置與小鼠的實際位置相差較大，說明在熟悉環(huán)境中可以通過星形膠質(zhì)細胞鈣活動解碼小鼠位置。
綜上所述，小鼠海馬體CA1區(qū)的星形膠質(zhì)細胞可以在熟悉的環(huán)境中通過觸覺記憶獎勵的預期位置，并且憑借星形膠質(zhì)細胞的活動可以在熟悉的環(huán)境中重建小鼠的運動軌跡。
以此類推，想要讓小毛驢一直追著胡蘿卜走，至少要做到以下幾點：
1.保持毛驢對蘿卜的渴望。
2.長時間重復訓練，讓毛驢每走一定步數(shù)或距離就可以吃到胡蘿卜。
3.使毛驢處于熟悉的環(huán)境中。這么看來，讓毛驢在蘿卜的誘惑下背著人走的難度實在有些高，還是訓練毛驢在蘿卜的誘惑下拉磨更有可行性一些。

【號外、號外】
EVIDENT 進一步完善活體雙光子鈣成像方案，震撼推出搭配內(nèi)調(diào)焦（電動快速可調(diào)焦透鏡）自由旋轉(zhuǎn)物鏡的龍門型雙光子顯微成像系統(tǒng)。



參考文獻：
[1]O'Keefe J, Dostrovsky J. The hippocampus as a spatial map: Preliminary evidence from unit activity in the freely-moving rat[J]. Brain research, 1971,34(1):171-5.
[2]Gauthier J L, Tank D W. A dedicated population for reward coding in the hippocampus[J]. Neuron, 2018, 99(1): 179-193.
[3]Doron A, Rubin A, Benmelech-Chovav A, et al. Hippocampal astrocytes encode reward location[J]. Nature, 2022, 609(7928): 772-778.