單細胞分析揭示的動脈粥樣硬化內皮細胞的新型表型調節(jié)因子-SOX4

動脈粥樣硬化是一種進行性血管疾病，其特征是在動脈內膜積聚的脂質、形成纖維脂質斑塊致管壁增厚、管腔狹窄。內皮細胞（ECs）的單層構成血管的內膜，負責生物力學信號的轉導和血管張力的調節(jié)。ECs功能障礙以內皮依賴性血管擴張和血管收縮不平衡為特征，提示動脈粥樣硬化性病變的起始。然而，動脈粥樣硬化過程中ECs的詳細轉錄圖譜、調控網絡和分子特征尚不完全清楚。

慢性血管炎癥提供了一個促動脈粥樣硬化的微環(huán)境，不斷刺激ECs，而這種不利條件與西方飲食的增加有關。在這種微環(huán)境中，分泌的細胞因子如白細胞介素-1β（IL-1β）和轉化生長因子β（TGF-β）的存在促使ECs的表型轉變。這種表型改變稱為內皮到間充質轉化（EndoMT），間充質樣ECs逐漸表達VSMC標志物，從而加重動脈硬化。

此外，血管ECs不斷暴露于血流產生的機械刺激（即剪切應力），其中不同的剪切模式觸發(fā)不同的細胞反應。穩(wěn)定層流剪切應力（LSS）可引起抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，振蕩剪切應力（OSS）則對應于促炎和促動脈粥樣硬化作用。然而，很少有研究將成熟和功能性ECs與間充質樣ECs的遺傳特征進行比較，特別是在動脈粥樣硬化性疾病的背景下。
 

在香港中文大學李嘉誠健康科學研究所、香港中文大學生物醫(yī)學學院、國家衛(wèi)生研究院細胞與系統(tǒng)醫(yī)學研究所的一項研究中，應用scRNA-seq方法（i）探索動脈粥樣硬化過程中主動脈ECs的轉錄景觀和異質性；（ii）在功能失調的ECs中鑒定新的和可成藥的分子靶點；（iii）將新確定的分子靶點與血管系統(tǒng)的病理狀況聯(lián)系起來；以及（iv）將實驗性動脈粥樣硬化的發(fā)現(xiàn)與人類動脈粥樣硬化疾病臨床標本中的動脈和ECs相關聯(lián)。研究結果將為確定針對動脈粥樣硬化疾病的替代治療策略開辟新的機會。以下為部分研究成果分享。
 

SOX4 在動脈粥樣硬化性主動脈中上調

由于轉錄因子（TFs）代表了真核細胞中各種信號通路的匯合點，因此直接調節(jié)TFs功能可能為不同疾�。ò�括動脈粥樣硬化）提供新的治療見解。在動脈粥樣硬化主動脈中，僅在EC和VSMC簇中檢測到TF Sox4的上調（圖1 A）。盡管在動脈粥樣硬化主動脈的EC中也注意到Tcf4上調（圖1 A），但其在多個細胞簇中的復雜表達變化表明，Tcf4可能參與多個細胞過程，但不僅僅參與動脈粥樣硬化期間的EC功能。為了解開這些TFs下游的效應基因，進行了相互作用組分析。此外，SOX4是某些間充質標志物（即VIM和FN1）的直接上游調節(jié)因子，如基因調控網絡分析所示（圖1 B）。在WD喂養(yǎng)的ApoE^−/− 小鼠主動脈根部和人動脈粥樣硬化冠狀動脈和腎動脈中，分別在斑塊區(qū)和EC層觀察到SOX4上調（圖1 C、E）。這種上調伴隨著小鼠主動脈和人動脈粥樣硬化腎動脈分離的ECs中內皮標志物（即eNOS和PECAM-1）的丟失和間充質標志物（即VIM）的增加（圖1 D、F）。
 

圖1   人和小鼠動脈粥樣硬化主動脈中的內皮SOX4上調。

（A）不同主動脈細胞中轉錄因子Sox4和Tcf4表達的圖。（B）SOX4與其他蛋白質相互作用組的基因調控網絡分析。（C）動脈粥樣硬化病變上的油紅O染色和ApoE-/- 小鼠主動脈根部SOX4表達的免疫組織化學染色。（D）來自ApoE−/− 小鼠分離的ECs的SOX4，內皮標志物（即eNOS和PECAM-1）和間充質標志物（即VIM）的蛋白質印跡表達水平。（E）人患病冠狀動脈和對照胸內動脈內皮細胞中SOX4的免疫熒光染色水平。（F）人腎動脈內皮（PECAM-1）和間充質（VIM）標志物水平的免疫熒光染色。ND：正常飲食；WD：西方飲食。

 

SOX4過表達的促動脈粥樣硬化和促EndoMT 效應

為了了解SOX4在動脈粥樣硬化中的作用，在WD喂養(yǎng)前，將內皮特異性AAV-SOX4注射到ApoE−/− 小鼠。結果表明，SOX4過表達增加了ApoE−/− 小鼠主動脈中SOX4蛋白的表達（圖2 A）。SOX4過表達增加了ApoE−/− 小鼠面主動脈和主動脈根部的病變區(qū)域（圖2 B、C）。此外，SOX4過表達導致分離的ECs和主動脈根部的內皮標志物（即eNOS和PECAM-1）丟失和間充質標志物（即VIM）的增加（圖2 A、D）。而且，體外腺病毒介導的SOX4過表達在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）和人主動脈內皮細胞（HAECs）中引起類似的結果（圖2 E-G）。與調控網絡一致（圖1 B），SOX4過表達增強了ECs中的VIM水平。

此外，實驗還研究了SOX4過表達對ECs形態(tài)和功能的影響。這種過表達觸發(fā)了HUVECs和HAECs的伸長（圖2 H），以及小鼠主動脈內皮依賴性松弛的損害（圖2 I），表示結構改變和內皮功能障礙。這些證據暗示了SOX4的促動脈粥樣硬化作用，這與SOX4介導的EndoMT有關。

圖2   SOX4在內皮細胞中的過表達。

（A）ApoE−/− 小鼠分離的ECs的蛋白質印跡，先前接受尾靜脈注射內皮特異性AAV-SOX4。（B、C）注射AAV-SOX4的ApoE−/− 小鼠的（B）面主動脈和（C）主動脈根部動脈粥樣硬化病變的油紅色O染色。（D）小鼠主動脈根部內皮和間充質標志物的免疫熒光染色。（E、F）在 Ad-SOX4 處理的（E）HUVECs 和（F）HAECs 上進行蛋白質印跡。（G）對Ad-SOX4感染的HUVECs的內皮和間充質標志物進行免疫熒光染色。（H）經Ad-SOX4處理的HUVECs的形態(tài)。（I）通過線肌圖對Ad-SOX4感染的C57BL / 6小鼠主動脈進行內皮依賴性松弛的功能測定。

 

二甲雙胍抑制細胞因子介導的SOX4上調

接下來，實驗旨在揭示SOX4的潛在誘導因子和抑制因子。值得注意的是，西方飲食模式通常與更高水平的循環(huán)細胞因子（例如IL-1β）相關，IL-1β和TGF-β1都是動脈粥樣硬化期間EndoMT誘導的細胞因子。此外，SOX4先前已被證明是免疫細胞（例如T細胞）中這兩種細胞因子的下游靶點。因此，實驗想知道IL-1β和TGF-β1是否作為內皮細胞中SOX4介導的EndoMT的上游啟動因子。事實上，用IL-1β（10 ng ml−1）進行體外孵育可誘導人腎動脈和 ApoE−/− 小鼠主動脈中的 SOX4 上調和 EndoMT（圖3 A-C）。然后進一步驗證了暴露于IL-1β和TGF-β1（另一種EndoMT誘導細胞因子）的HUVECs的結果。兩種細胞因子的共同處理顯著增加了HUVECs中的SOX4蛋白表達和EndoMT（圖3 D）。更重要的是，用抗糖尿病藥物二甲雙胍處理，先前報道是癌中的 SOX4抑制劑，逆轉了細胞因子誘導的HUVECs中SOX4表達和EndoMT的升高（圖3 D）。更重要的是，siRNA介導的SOX4敲低也逆轉了HUVECs中細胞因子誘導的EndoMT（圖3 E）。
 

圖3   SOX4上調的生化誘導因子。

（A）IL-1β處理的人腎動脈SOX4表達的免疫組織化學染色。（B）IL-1β處理的人腎動脈上的蛋白質印跡。（C）IL-1β 處理的 ApoE−/− 小鼠主動脈的蛋白質印跡。（D）二甲雙胍在IL-1β和TGF-β1共同處理的HUVECs中的影響。（E）siRNA介導的SOX4敲低在IL-1β和TGF-β1共同處理的HUVECs中的影響。

 

OSS 誘導的 SOX4 上調

動脈粥樣硬化斑塊和動脈瘤往往發(fā)生在暴露于血流紊亂的血管區(qū)域。由于OSS經歷區(qū)域（例如小鼠主動脈根部）中的SOX4表達很高（圖1 C），實驗假設除了細胞因子介導的生化刺激外，SOX4可能對血流誘導的機械刺激敏感。由于相對直的TA和彎曲的AA分別對應于LSS（12 dyn cm2）和OSS（0.5 ± 6 dyn cm2，1 Hz）（圖4 A），實驗檢查了這些血管區(qū)域的SOX4水平。位于AA內曲率的ECs中的SOX4表達增加（圖4 B），同時AA的整體SOX4表達也較高（圖4 C）。然后進一步驗證了在體外受血流動力學力作用的HUVECs的結果（圖4 D）。暴露于OSS（0.5 ± 6 dyn cm2，1 Hz）24小時后，HUVECs的SOX4水平在轉錄和翻譯上均升高（圖4 E），與體內結果一致。
 

圖4   SOX4上調的生物力學誘導因子。

（A）沿主動脈的不同流動模式示意圖。（B）小鼠胸主動脈（TA）和主動脈弓（AA）的面部SOX4表達的免疫熒光染色。（C）小鼠TA和AA中SOX4水平的蛋白質印跡。（D）流動系統(tǒng)設計示意圖和細胞室橫截面。（E）暴露于LSS或OSS 24小時的HUVECs中SOX4水平的蛋白質印跡。
 

圖5   圖形概要

高脂血癥相關的細胞因子和紊亂的血流上調ECs中SOX4的表達，其中SOX4促進EndoMT和動脈粥樣硬化發(fā)生。 二甲雙胍在藥理學上抑制ECs中的SOX4水平。

 

綜上所述，該研究揭示了小鼠動脈粥樣硬化主動脈的細胞組成和轉錄譜，并根據轉錄和細胞異質性將ECs分為兩個亞群。此外，SOX4被成功鑒定為人類和小鼠動脈粥樣硬化的新標志物。高脂血癥相關細胞因子和流體剪切應力被確定為介導SOX4上調的上游刺激，從而為SOX4加速動脈粥樣硬化進展提供了機制見解。二甲雙胍被證明可以抑制細胞因子誘導的SOX4上調，為動脈粥樣硬化疾病開辟了新的治療機會。

 

參考文獻：Cheng CK, Lin X, Pu Y, Tse JKY, Wang Y, Zhang CL, Cao X, Lau CW, Huang J, He L, Luo JY, Shih YT, Wan S, Ng CF, Wang L, Ma RCW, Chiu JJ, Chan TF, Yu Tian X, Huang Y. SOX4 is a novel phenotypic regulator of endothelial cells in atherosclerosis revealed by single-cell analysis. J Adv Res. 2023 Jan;43:187-203. doi: 10.1016/j.jare.2022.02.017. Epub 2022 Mar 1. PMID: 36585108.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36585108/

 

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