蛋白質質譜鑒定的方法與流程

蛋白質根據(jù)樣品的純度，鑒定精度的要求不同，可以分為對一級質譜，二級質譜（即串聯(lián)質譜）。很多剛接觸蛋白質鑒定的新手很可能對一級、二級質譜鑒定方法還不太了解。在這期文章中，小編就通過蛋白質鑒定的流程來系統(tǒng)地幫大家梳理一下蛋白質鑒定的基礎知識，幫助大家選用適合的蛋白質鑒定方法。

如下圖所示，蛋白質質譜鑒定一般都包含幾個過程：蛋白質分離、蛋白質酶切、一級質譜鑒定、二級質譜鑒定。蛋白質分離是指蛋白質從細胞中分離純化的過程，在進入質譜儀分析前需要對純化的蛋白質酶切成多肽片段，經(jīng)過一級、二級兩個層級的質譜分析對蛋白質進行逐級分析，隨著層級的加深，蛋白質序列分析的精度，蛋白質鑒定的準確度也得到提升。

蛋白質質譜鑒定

蛋白分離純化
在對細胞中的蛋白質分析鑒定前，首先需要對細胞進行破碎，將總蛋白質分離提純，接著再將目標蛋白分離出來，進行進一步分析。然而在蛋白質分離純化的過程中也有一下可能影響后續(xù)蛋白質鑒定效率的因素需要考慮：

1. 蛋白質濃縮

蛋白質樣品可以用沉淀，膜分離，分離柱，冷凍干燥等各種方式進行濃縮， 具體蛋白濃縮方法應根據(jù)樣品的特點進行選擇，可用SDS樣品液從色譜樣上中洗脫蛋白，從而保持樣本體積較小。
2. 蛋白質凝膠電泳

對于SDS- PAGE，傳統(tǒng)的Laemmli式，三甘氨酸凝膠及其各種改進型的凝膠，如二，三凝膠或三鹽酸凝膠， 都可以兼容于蛋白質鑒定。各種凝膠濃度也沒有限制。用戶選擇凝膠的類型，應根據(jù)能夠實現(xiàn)對樣本的更好的分離效果而定。 出于未知原因，三，黃酮凝膠與蛋白質識別的相容性要差一些。
3. 蛋白質凝膠染色

傳統(tǒng)的考馬斯（G250或R - 250）染色劑能夠有效地對蛋白質的染色。膠狀考馬斯染色劑包有更低的檢測范圍 (~5 ng BSA)。其他的染色方法，如鋅/銅染色，熒光染料染色，銀染色法都是可以用于蛋白質鑒定。
4. 蛋白條帶切割

凝膠在切割過程中應避免與手，燈箱， 或任何其他可能的角蛋白污染源直接接觸。在切割蛋白膠帶適應盡量避免割下空白凝膠（它可能降低酶切的消化效率和多肽的回收率）。 將每個凝膠帶置于干凈的，1.5毫升的微型離心管并給每個樣本小心地做上標簽。

蛋白質酶切消化
蛋白質在質譜鑒定前通常需要經(jīng)過蛋白質酶切消化步驟，將大分子蛋白質酶切成多肽片段，以便于提升質譜鑒定的精度。蛋白質酶切通常選用胰蛋白酶進行蛋白質酶切處理，有時也會根據(jù)預測的蛋白質序列選測多種其他蛋白酶進行酶切。蛋白質經(jīng)過蛋白酶的酶切消化后成肽段混合物，再經(jīng)過高效液相色譜對多肽片段進行初步分離，以進一步提升質譜鑒定的準確度。

蛋白質一級質譜鑒定
蛋白質一級質譜鑒定主要便是通過測定蛋白質酶切產(chǎn)生的肽段質量圖譜，即肽質指紋譜（peptide mass fingerprint，PMF），再將測定的肽質量與數(shù)據(jù)庫中理論肽質量相配比（理論肽是由實驗所用的酶來"斷裂"蛋白所產(chǎn)生的）。配比的結果是按照數(shù)據(jù)庫中肽片段與未知蛋白共有的肽片段數(shù)作一排行榜，"冠軍"肽片段可能代表一個未知蛋白。若冠亞軍之間的肽片段存在較大差異，且這個蛋白可與實驗所示的肽片段覆蓋良好，則說明正確鑒定的可能性較大。

肽段在質譜分析前首先經(jīng)過離子化，時肽段帶上一定量的電荷。通過檢測器分析，可得到各肽段的質荷比（m/z），從而得知各肽段的相對分子質量。目前常用的離子化的方法有兩種：基質輔助激光解析電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）。MALDI電離的基本原理是將蛋白樣品點在基質分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質晶體升華，致使基質和分析物膨脹并進入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質譜圖多為單電荷離子，因而質譜圖中的離子與多肽和蛋白質的質量有一一對應關系。ESI電離是在毛細管的出口處施加一高電壓，產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。

蛋白質質譜鑒定流程

蛋白質串聯(lián)質譜鑒定
在第一階段進行肽質指紋鑒定之后，一個有意義且豐度高的肽片段在質譜儀被選作"母離子"，母離子飛行至耳機質譜反應器中碰撞碎裂為"子離子"。在反應器中，用逐漸降低的電壓可測量至檢測器的不同大小的片段。 連續(xù)的片段間差異即是肽片段的氨基酸質量。由氨基酸的質量可以推測出氨基酸的類別以及氨基酸上面可能發(fā)生的翻譯后修飾。連續(xù)測得的氨基酸序列組成肽序列標簽。然后，使用多個肽序列標簽與數(shù)據(jù)庫中蛋白質的序列進行比對，鑒定出目的蛋白質。

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