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多重?zé)晒饷庖呓M化實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)問(wèn)答(三)

瀏覽次數(shù):707 發(fā)布日期:2023-5-9  來(lái)源:absin

Q1:我該如何得到完美的多色結(jié)果呢?

A1:首先,您需要有質(zhì)量不錯(cuò)的樣本和抗體,這就已經(jīng)是成功的一半(樣本、抗體選擇攻略),對(duì)于樣本來(lái)說(shuō),脫片是我們需要預(yù)防的“頭號(hào)公敵”,多色實(shí)驗(yàn)需要重復(fù)熱修復(fù)洗脫抗體多次,假如片子脫片,輕則成像模糊,重則組織脫落前功盡棄,可以在開始實(shí)驗(yàn)之前先模擬幾輪熱修復(fù),不加抗體和其他試劑,看看組織是否有脫落的跡象,如果脫落比較嚴(yán)重,則需要重新制備切片,如果有輕微脫片,則可以考慮購(gòu)買抗體洗脫液,替代熱修復(fù)的過(guò)程;然后,就可以開始做實(shí)驗(yàn)了,我們建議您先進(jìn)行抗體和染料工作條件摸索,再上多染(參考下圖流程),這樣多染的成功率可以達(dá)到90%以上哦。ㄐ(ài)經(jīng)驗(yàn)之談,即便是染了千百遍的常見(jiàn)指標(biāo),換個(gè)樣本,染色效果就可能天差地別,有條件還是建議要做預(yù)實(shí)驗(yàn)。)
 


最后的10%,就需要調(diào)整指標(biāo)與染料搭配以及染色的順序了。

 

Q2:有沒(méi)有推薦的染料搭配和染色順序呢?
 

A2:染料搭配一般遵循“寡靶配強(qiáng)光,眾靶配弱光”的原則,意思是表達(dá)比較弱的指標(biāo)搭配熒光信號(hào)比較強(qiáng)的染料,表達(dá)相對(duì)強(qiáng)的指標(biāo)搭配信號(hào)比較弱的染料,Absin的TSA染料波長(zhǎng)越短熒光強(qiáng)度越強(qiáng),比如說(shuō)需要染PD-1,CD8和CD3,我們手里有一個(gè)四色試劑盒(TSA520/TSA570/TSA650),通過(guò)IHC發(fā)現(xiàn)樣本中PD-1的信號(hào)很少,CD3信號(hào)非常多,其次是CD8,于是選擇TSA520搭配PD-1,TSA650搭配CD3,TSA570搭配CD8,比較合理。
 

接下來(lái)就是怎么安排染色先后順序

1)劃分細(xì)胞定位,先外后內(nèi):確定每個(gè)指標(biāo)的細(xì)胞定位,膜表達(dá)先染,胞漿或者胞核的后染(如果是指標(biāo)比較多的情況下,胞內(nèi)指標(biāo)排在比較后面,經(jīng)過(guò)前期多輪洗脫,可以不做細(xì)胞通透;如果指標(biāo)很少,染胞內(nèi)指標(biāo)之前還是需要打孔,多個(gè)胞內(nèi)指標(biāo)也只需要打一次孔);
2)確定抗原修復(fù)方式,先酸后堿:堿修復(fù)比酸修復(fù)的力度會(huì)更強(qiáng),個(gè)別抗體在用堿修復(fù)以后會(huì)染出來(lái)很多非特異性,所以如果是相同的細(xì)胞定位,就先染酸修復(fù),再染堿修復(fù)的抗體;
3)根據(jù)IHC結(jié)果判別,先弱后強(qiáng):組化結(jié)果顯示指標(biāo)比較少,比較弱的,排在前面染,理論上來(lái)說(shuō)越靠前染的指標(biāo)效果會(huì)越接近單標(biāo)染色。
 

以上就是一些通用規(guī)則,但不同的指標(biāo)還是可能出現(xiàn)變化,要想得到最完美的結(jié)果,就需要不同的排列組合一個(gè)一個(gè)嘗試(如下表,“X”代表有信號(hào)),這樣會(huì)比較耗費(fèi)時(shí)間和試劑,您可以根據(jù)通用規(guī)則先行一次多染,然后各通道跟熒光單染做對(duì)比,如果效果差別很大,那就再調(diào)整染色順序,如果單染的結(jié)果跟組化差別比較大(出現(xiàn)高背景,非特異性明顯),就要考慮更換染料搭配。
 

Target Best Signal Recommended
Dilution
1st AR 3rd AR 6th AR
FOXP3     x 1:250
PD-1 x     1:250
LAG3   x x 1:250
CD4   x x 1:250


Q3:我成像完了以后想要做數(shù)據(jù)分析,你們有什么軟件推薦嗎?
 

A3:目前市面上數(shù)據(jù)分析軟件還是比較多的,像免費(fèi)的您可以下載imageJ、Qupath,缺點(diǎn)就是用法都需要您自行摸索;我們公司安裝的是HALO和StrataQuest兩款軟件,HALO是付費(fèi)的,StrataQuest是我們TG的掃描儀平臺(tái)自帶的,從功能、分析的精準(zhǔn)度和可操作性來(lái)說(shuō),肯定是大大優(yōu)于開源軟件的,且有軟件專業(yè)的技術(shù)支持團(tuán)隊(duì)能夠答疑解惑。您可以根據(jù)您的實(shí)際情況選擇合適的分析軟件,如果您實(shí)在無(wú)從下手,也可以找Absin,我們可以提供數(shù)據(jù)分析的服務(wù)~

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