外泌體藥物遞送的相關基礎研究和工業(yè)發(fā)展的綜述與回顧

外泌體是由細胞分泌的膜性小囊泡，內(nèi)含豐富的生物活性分子，且具有將生物活性分子運輸?shù)绞荏w細胞的能力，因而在載藥領域被廣泛研究且熱度持續(xù)高走。近期，Tenchov等人檢索并分析了CAS數(shù)據(jù)庫中外泌體(extracellular vesicles, EVs)在治療和診斷領域中應用研究的發(fā)表情況。如圖1所示，有超過4萬篇與EV相關的科學論文（主要是期刊文章和專利）,其中與EV在藥物傳遞和診斷有關的論文超過25000篇；且2015年后來自美國機構(gòu)的文獻數(shù)量與美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的資助急劇增加，其中，中國、美國、韓國和日本的相關發(fā)表期刊文章和專利數(shù)量上處于領先地位。

圖1. 基于EV載藥和診斷的研究論文和專利發(fā)表趨勢及該領域研究經(jīng)費與資助項目統(tǒng)計

本期文章，小編將對近年來基于EVs的藥物遞送的相關基礎研究和工業(yè)發(fā)展進行簡單綜述與回顧。

藥物遞送：EV向左，LNP向右？

自上世紀90年代以來，合成納米顆粒逐漸被應用于臨床給藥，以滿足降低藥物副作用和/或提高治療效果的需求。脂質(zhì)納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs)已被證實是保護和運輸各種藥物或者疫苗的有效載體，也促成了LNPs的臨床轉(zhuǎn)化。其中，脂質(zhì)體作為一種早期具有膜結(jié)構(gòu)的LNPs，在小分子、蛋白肽段和核酸等遞送方面充分展現(xiàn)了其靈活性和高效性。

除了合成的納米載體，外泌體為基礎的載體系統(tǒng)也引起了基礎研究和工業(yè)界相當大的興趣。外泌體作為細胞間通訊的重要信使，它們將生物分子運輸?shù)绞荏w細胞的能力使其在藥物輸送方面極具吸引力。外泌體在大小、形狀和結(jié)構(gòu)上與脂質(zhì)體相似，但具有更復雜的脂質(zhì)雙分子層，包含多達數(shù)百種不同的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物類型，以及內(nèi)部貨物和表面相關分子。雖然與脂質(zhì)體類似，但是外泌體具有更高的膜曲度和膜不對稱性，被證明更利于與細胞膜間的相互作用；且外泌體表面豐富的膜蛋白在藥物遞送方面也賦予其更多的可能性�？偟膩碚f，相比于人工合成的納米載體，外泌體在作為遞送載體方面具有諸多優(yōu)勢。首先，外泌體衍生于細胞，在藥物遞送結(jié)束后更容易被代謝；其次，外泌體展現(xiàn)了更低的免疫原性，避免引起不需要的免疫反應；此外，外泌體可跨越諸如血腦屏障等其他納米載體難以逾越的體內(nèi)屏障。在過去的3到4年間，根據(jù)文章發(fā)表和專利申請數(shù)量，外泌體相比于LNPs在藥物遞送方面的熱度逐年攀升（圖2）。

圖2. 外泌體和LNPs應用于藥物遞送的研究進展

載藥方法：親本細胞修飾 or EV工程化
近年來，已經(jīng)有多種外泌體載藥和修飾平臺的相關報道，用于小分子、核酸類以及蛋白肽等藥物分子的裝載。這些遞送系統(tǒng)在靶向性、安全性和藥代動力學方面均表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢。目前基于外泌體的遞送平臺主要分為兩大類（詳見下表1）通過親本細胞修飾的外泌體工程化

通過親本細胞修飾的外泌體工程化
采用基因工程、代謝標記和外源導入等策略對親本細胞進行特異性修飾，從而使得這些細胞分泌的外泌體攜載自己的目標分子

外泌體的直接工程化
在分離和收集外泌體后采用孵育、超聲、電穿孔、反復凍融、擠壓以及脂質(zhì)體融合等技術，在外泌體表面或者內(nèi)腔修飾和裝載所需藥物或者靶向試劑
 

表1. 不同載藥方法對比

通過親本細胞修飾的外泌體工程化
a 基于細胞基因改造的外泌體工程化
基因工程作為細胞修飾策略中一項最為成熟的技術，在外泌體的修飾之中被廣泛應用。目前，exoIL-12作為全球首個完成Ⅰ期臨床的工程化外泌體候選藥物，即是基于Codiak Biosciences公司的engEx™外泌體藥物遞送平臺開發(fā)成功。該平臺通過對親本細胞的基因改造，從而實現(xiàn)其來源外泌體的藥物遞送和蛋白表達，并靶向到特定的組織與器官起到治療作用。Codiak成功篩選到PTGFRN這一幾乎在所有外泌體中均高表達的蛋白。通過基因工程手段將IL-12和PTGFRN融合表達，實現(xiàn)外泌體對IL-12藥物的高效裝載。該方法實現(xiàn)了IL-12腫瘤微環(huán)境的定向遞送，增強了IL-12的劑量，并減少IL-12的全身暴露，有效激活人體免疫系統(tǒng)對腫瘤的免疫反應。此外，全球領先的制藥公司阿斯利康也基于NanoFCM平臺篩選得到了TSPAN14和CD63兩個骨架蛋白，用于其外泌體載藥平臺的開發(fā)(詳見往期文章：最新：福流助力Codiak公司外泌體候選藥物exoIL-12進入臨床I期)。

此外，來自美國俄亥俄州立大學、梅奧醫(yī)學中心以及中國 吉林大學的研究者們對經(jīng)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的細胞通過局部瞬間電刺激，促進攜帶mRNA和靶向肽的外泌體的大量釋放。與其他外泌體生產(chǎn)策略相比，細胞局部電刺激穿孔方法使得外泌體產(chǎn)量提高了50倍，攜載的mRNA含量增加了1000倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該mRNA高載量的外泌體可恢復原位磷酸酶和PTEN缺陷的膠質(zhì)瘤小鼠的腫瘤抑制功能并增加了小鼠的生存率。哈佛大學醫(yī)學院和加州巴克老化研究所的研究人員通過細胞中和外泌體中富集的miRNA的序列分析，并結(jié)合RNA結(jié)合蛋白等的實驗驗證，系統(tǒng)性的闡釋了miRNA分選進入外泌體的具體機制。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過添加特定的核酸序列并與相對應的RNA結(jié)合蛋白識別，促進在外泌體中富集并進而調(diào)控受體細胞功能的可行性�；�于該調(diào)控機制，作者通過基因工程的方法在不同miRNA上引入該序列，結(jié)果顯示這些miRNA在外泌體中的含量上調(diào)可高達20倍。該項研究將極大的推動外泌體作為核酸類藥物遞送載體的發(fā)展。

b 基于細胞代謝標記的外泌體工程化
代謝標記是一種完善的細胞功能化策略，它規(guī)避了遺傳操作的許多問題。可通過向細胞培養(yǎng)基中添加非天然代謝物(如氨基酸、脂類、寡核苷酸或聚糖)來劫持細胞生物合成。這些代謝物被細胞吸收，并分別整合到細胞的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、基因以及糖類等物質(zhì)中。因此，外泌體可在其形成和分泌過程中，實現(xiàn)這些代謝標記產(chǎn)物的攜載。美國塔夫斯大學研究者們通過細胞代謝標記的方法實現(xiàn)EVs的工程化改造。研究者們將非天然氨基酸L-azidohomoalanine作為甲硫氨酸的替代品插入到細胞蛋白之中，以及利用N-azidoacetyl-D-mannosamine糖前體在唾液酸中引入疊氮基團。另外，來自廈門大學楊朝勇教授團隊開發(fā)了一種基于核酸適配體蛋白標記以及聚糖代謝標記的雙重標記策略，實現(xiàn)了外泌體表面PD-L1糖基化的原位成像，使得其生物學功能研究成為可能。利用這一策略，首次證實外泌體表面PD-L1的糖基化是其與PD-1蛋白作用的必要條件，并可參與抑制CD8 T細胞的增殖。

c 基于細胞外源導入的外泌體工程化
通過向細胞中引入外源材料，隨后可以將其包裝于外泌體之中。而該方法一般需要高的納米顆粒濃度和較長的孵育時間來最大限度地提升細胞所負載的納米顆粒含量，從而提升在外泌體中的載量。例如，德國細胞生物學和神經(jīng)生物學研究所的研究人員使用0.5 mM超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIONs)與神經(jīng)元細胞孵育24小時，以從神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生負載該納米顆粒的外泌體。Silva等人利用將巨噬細胞強大吞噬功能這一特點，將巨噬細胞與氧化鐵納米顆粒和小分子光敏劑孵育，用以產(chǎn)生磁性和光學響應的外泌體。Lee等人則使用膜融合脂質(zhì)體將疏水的有效物質(zhì)運送到細胞質(zhì)膜，將親水物質(zhì)運送到細胞質(zhì)中，進而采用該細胞收獲得到所需的外泌體。有趣的是，研究者們發(fā)現(xiàn)輸送到細胞的脂質(zhì)含量與可運輸?shù)酵饷隗w中的脂質(zhì)含量不成比例。

外泌體的直接工程化
a 基于電穿孔的外泌體工程
早在十年前，牛津大學Matthew J A Wood教授團隊即采用電穿孔的方式將siRNA裝載于外泌體之中，并采用基因工程的方法將靶向大腦組織的RVG肽段與外泌體高豐度蛋白Lamp2b融合表達以提升其靶向能力。通過靜脈注射該工程化外泌體，其被特異性地傳遞到大腦中的神經(jīng)元、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞，并導致特定基因敲除，在阿茲海默癥的治療中發(fā)揮了優(yōu)異的效果。且研究者沒有觀察到該工程化外泌體在其他組織的特異性富集。來自美國安德森癌癥中心的Raghu Kalluri教授團隊同樣采用電穿孔的方法將siRNA導入到外泌體和脂質(zhì)體中，并首次對比了這兩種載體在遞送和治療胰腺癌中的優(yōu)劣性。研究發(fā)現(xiàn)外泌體含有可能增強內(nèi)吞作用的跨膜和膜錨定蛋白，從而促進其內(nèi)容物的遞送；此外，表達于外泌體表面的CD47蛋白可有效避免循環(huán)系統(tǒng)中的巨噬細胞對其進行清除，極大增加了其體液循環(huán)時間。此外，北卡羅納大學Cheng Ke教授團隊也通過電穿孔方法在肺細胞來源的外泌體、HEK293T細胞來源的外泌體和人工合成的脂質(zhì)體中分別裝載mRNA分子，并比較了三種載體在成為新冠病毒mRNA疫苗的差異。

b 基于超聲/擠壓的外泌體工程化
如何在外泌體中裝載足量的藥物分子，一直是該領域一項亟需解決的瓶頸問題。來自廈門大學顏曉梅教授和集美大學陳超翔副教授團隊開發(fā)了一種主動載藥的外泌體藥物分子裝載策略，實現(xiàn)了阿霉素分子的高效且穩(wěn)定的外泌體包封。與被動裝載方法相比較，該方法的載藥量提高了10倍以上。通過NanoFCM技術確認了只有脂膜包裹的顆粒具有阿霉素分子的負載，而其中的主要雜質(zhì)酪蛋白幾乎不含有阿霉素分子。這些發(fā)現(xiàn)也進一步激發(fā)了基于脂質(zhì)探針和免疫介導的磁分離技術，選擇性地去除非脂質(zhì)封閉顆粒和酪蛋白組合的污染物。(詳見往期文章：JEV：牛奶外泌體載藥新突破）

c  基于外泌體+脂質(zhì)體融合載藥
來自于中山大學和耶魯大學的研究者們則將脂質(zhì)體與外泌體進行融合，在保留外泌體天然活性的同時，兼具了脂質(zhì)體成熟的高效藥物分子裝載。研究者們首先利用基因工程的方法，在外泌體表面高表達CD47蛋白，提高其免疫逃逸能力，同時利用熱敏脂質(zhì)體裝載抗癌藥物，將兩者進行融合，用NanoFCM測定融合效率高達95.7%。這種策略構(gòu)建的工程化外泌體既能避免被機體免疫清除，同時又高效裝載了治療藥物。(詳見往期文章：NanoFCM助力新型抗癌藥物研發(fā)）

外泌體藥物遞送的工業(yè)發(fā)展
外泌體在藥物遞送方面所展現(xiàn)的巨大潛能，使得其日漸成為工業(yè)界的寵兒。大量涉及大型制藥公司的交易表明，制藥行業(yè)正在將外泌體作為一種克服目前核酸療法難以運輸至某些組織的手段。

僅在2020年6月份，禮來、武田和拜耳就宣布了涉及外泌體科技公司的超過10億美元的交易。此外，近年來涌現(xiàn)了幾家新公司，專注于開發(fā)治療性外泌體，作為蛋白、基因和RNA治療等的傳遞載體。據(jù)不完全統(tǒng)計，近些年涌現(xiàn)出來的外泌體領域相關的新興創(chuàng)業(yè)公司有近100家。位于美國馬薩諸塞州劍橋市的Codiak BioSciences是第一家把工程化外泌體療法推向人體臨床試驗的單位，這家公司有兩款產(chǎn)品進入臨床試驗：一項是exoSTING在外泌體的腔內(nèi)裝載了STING（一類干擾素IFN的刺激基因）激動劑用于治療晚期實體瘤；另一項exoIL-12則是將外泌體進行工程化修飾，使其在表面展示IL-12，用于治療早期皮膚T細胞淋巴瘤。雖然Codiak公司已于今年3月申請破產(chǎn)，但它作為外泌體行業(yè)先驅(qū)，為外泌體大規(guī)模生產(chǎn)、純化工藝和表征質(zhì)控等行業(yè)難題的解決，奠定了重要的基礎，對外泌體行業(yè)的貢獻不言而喻。

除了生物科技公司和藥企巨頭之外，近兩年來眾多的供應商也持續(xù)發(fā)力，頻頻達成多個重磅戰(zhàn)略合作。CDMO全球霸主LONZA集團先后收購了Exosomics的服務單元和Codiak的外泌體生產(chǎn)工廠，積極布局外泌體服務，已形成意大利Siena、瑞士Basel、美國得克薩斯州Houston、馬里蘭州Rockville和馬薩諸塞州Lexington等多中心的服務網(wǎng)絡。RoosterBio作為行業(yè)領先的MSC和外泌體技術平臺供應商，分別與賽多利斯、NanoFCM、Univercells及ShiftBio等達成合作。國內(nèi)方面，中國企業(yè)蓄勢以待，2015年前后中國外泌體企業(yè)如雨后春筍般紛紛成立，資本更是頻頻出手，多家企業(yè)對外公布融資情況。

截止目前，納米流式檢測技術已經(jīng)進入由中國研究型醫(yī)院學會細胞外囊泡研究與應用分會圍繞SC-EVs制定的兩項全國團體標準中，以及由上海市生物醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會依據(jù)協(xié)會制定的《間充質(zhì)干細胞外泌體質(zhì)量控制標準》（T/SBIAORG 001-2023）團體標準中，期待未來在解決外泌體大規(guī)模生產(chǎn)、純化工藝和表征質(zhì)控的難題，為行業(yè)提供完整的解決方案。

展望
外泌體已被證明其在藥物遞送方面的巨大潛力，且該領域產(chǎn)業(yè)發(fā)展的如火如荼。但是相比于病毒和脂質(zhì)納米顆粒等日趨成熟的遞送載體，外泌體藥物遞送的發(fā)展也才近10年的時間，外泌體載體的商業(yè)化之路仍然任重而道遠。這需要更多的臨床相關系統(tǒng)評估，并與脂質(zhì)體等替代方案進行直接、定量的比較，以全面評估風險-效益比。在此過程中，越來越多的新分析技術有望為外泌體的獨特性提供新的見解，并可能激發(fā)下一代遞送系統(tǒng)的設計與開發(fā)。

參考文獻

1. Kenneth W. Witwer and Joy Wolfram et al., Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Materials, 2021, 6, 103-106.

2. Rumiana Tenchov, Janet M. Sasso, Qiongqiong Angela Zhou et al. Exosomes—Nature's Lipid Nanoparticles, a Rising Star in Drug Delivery and Diagnostics. ACS Nano 2022, 16, 17802−17846.