動(dòng)物實(shí)驗(yàn)整體課題——驗(yàn)證基因功能常見(jiàn)思路解析

師兄做了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)，老師說(shuō)讓我從這個(gè)數(shù)據(jù)里挖掘一下信息作為我下一步課題的開(kāi)始，我該怎么做呢？估計(jì)很多科研者都會(huì)碰到此類的問(wèn)題。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一般是通過(guò)高通量的方式把對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的所有基因的RNA表達(dá)水平差異檢測(cè)出來(lái)，雖然數(shù)據(jù)只有參考價(jià)值，但是可以進(jìn)行大批量的篩選差異基因，進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，這也是大家都會(huì)用到的方法。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序選擇差異基因，需要繼續(xù)在動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證基因功能，其中細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基因功能驗(yàn)證小編前面已經(jīng)寫(xiě)過(guò)，在此就不表述了，下面講講動(dòng)物模型中的檢驗(yàn)；
 
1. 首先通過(guò)查閱文獻(xiàn)以及其他人已發(fā)布的芯片數(shù)據(jù)，進(jìn)行目標(biāo)疾病或者目標(biāo)表現(xiàn)的差異基因資料查詢，此外也可以自己收集對(duì)照組和處理組的樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分析數(shù)據(jù)，最終都是確定預(yù)期靶標(biāo)基因；
2. QPCR、WB或者免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行表達(dá)量驗(yàn)證：一般先進(jìn)行QPCR表達(dá)量驗(yàn)證，若是臨床疾病的差異基因A，可以使用臨床樣本的免疫組化/免疫熒光進(jìn)行差異基因表達(dá)量驗(yàn)證；
 
免疫熒光實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表達(dá)量：
  
3. 確定表達(dá)確實(shí)有差異后，進(jìn)行動(dòng)物模型造模，動(dòng)物模型種類比較多，下面簡(jiǎn)單列一些，針對(duì)這些模型進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)：
 

裸鼠成瘤模型	大鼠皮下植入模型
大鼠頸動(dòng)脈狹窄模型	大鼠皮膚缺損模型
大鼠膽結(jié)石模型	兔骨缺損模型
小鼠肺損傷模型	大鼠MCAO模型
豚鼠過(guò)敏性鼻炎模型	小鼠胚胎種植
大鼠脊髓損傷模型	大鼠心肌損傷模型
大鼠細(xì)菌肺炎模型	大鼠脂肪肝模型
大鼠一型糖尿病模型	大鼠肝纖維化模型
大鼠一型糖尿病模型	大鼠結(jié)腸炎模型
大鼠心肌缺血再灌注模型	大鼠酒精性肝炎模型
大鼠腹部感染模型	大鼠睡眠剝奪模型
大鼠血糖波動(dòng)模型	小鼠腸炎模型
小鼠動(dòng)脈粥樣硬化模型	呼吸系統(tǒng)疾病動(dòng)物模型
大鼠腦死亡模型	大鼠坐骨神經(jīng)壓迫致痛模型
小鼠銀屑病模型	6-OHDA損毀建立部分損傷PD模型

（1）動(dòng)物造模預(yù)實(shí)驗(yàn)（通過(guò)文獻(xiàn)查閱，設(shè)計(jì)模型預(yù)實(shí)驗(yàn)，判斷動(dòng)物造模成功率以及時(shí)間安排情況，此處以大鼠頸動(dòng)脈狹窄模型作為案例）
①對(duì)照組，6只
②模型組，6只
頸動(dòng)脈狹窄（CAS）模型建立：Wistar 大鼠，麻醉后暴露小鼠單側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉頸總動(dòng)脈，在頸動(dòng)脈近心端切開(kāi)小口，使用導(dǎo)絲探入頸總動(dòng)脈旋轉(zhuǎn)摩擦破壞動(dòng)脈內(nèi)膜。生理鹽水沖洗動(dòng)脈腔，縫合切口，恢復(fù)血運(yùn)。
 
取材：
a造模后在15d和24d對(duì)2組動(dòng)物分別處死3只，取狹窄側(cè)頸動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行HE染色，判斷造模效果。
B 造模后15d和24d取血清以及狹窄側(cè)頸動(dòng)脈標(biāo)本進(jìn)行-80凍存，進(jìn)行QPCR和WB檢測(cè)，初步判斷A基因在此模型中表達(dá)量是否有差異，此外A基因調(diào)控的下游信號(hào)通路：例如周期或者凋亡相關(guān)信號(hào)通路是否也有差異。
 
HE結(jié)果顯示頸動(dòng)脈造模效果
 
WB檢測(cè)結(jié)果（A基因和內(nèi)參actin） （2）動(dòng)物正式實(shí)驗(yàn)（此處以大鼠頸動(dòng)脈狹窄模型作為案例，抑制劑為目標(biāo)基因A的抑制劑，進(jìn)行動(dòng)物注射，也可以用腺相關(guān)病毒注射進(jìn)行A基因的過(guò)表達(dá)或者敲低）
①對(duì)照組，6只
②模型組，6只
③模型組+抑制劑，6只
 
造模15d后，全部處死取材：血清、頸動(dòng)脈狹窄端、糞便，進(jìn)行生化檢測(cè)、ELISA檢測(cè)、HE、免疫熒光檢測(cè)、QPCR、WB、16s細(xì)菌多樣性檢測(cè)等方法進(jìn)行后續(xù)機(jī)制研究；
 
Α-SMA免疫熒光染色結(jié)果
對(duì)照組

 
模型組

 
模型組+抑制劑組

 
ELISA檢測(cè)結(jié)果
 
常規(guī)的動(dòng)物造模實(shí)驗(yàn)都會(huì)包含預(yù)實(shí)驗(yàn)，正式實(shí)驗(yàn)。而正式實(shí)驗(yàn)就需要通過(guò)常規(guī)的病理染色、蛋白平臺(tái)、分子平臺(tái)等實(shí)驗(yàn)手段，可能還會(huì)增加微生物實(shí)驗(yàn)、CT掃描、TTC染色、行為學(xué)檢測(cè)等，這些都因?yàn)槟Ｐ筒煌�研究的通路不同而有所差異，但是思路都是相通的，需要了解這個(gè)模型足夠多的背景文獻(xiàn)和已經(jīng)發(fā)表的機(jī)制進(jìn)展，進(jìn)而選擇可能的新機(jī)制。