雜交瘤基因測序流程介紹

1.什么是雜交瘤測序

雜交瘤細胞抗體基因測序是指使用專業(yè)的兼并引物設計（degenerate primer）和測序方案，同時優(yōu)化經濟成本和時間成本，為客戶提供快速準確的抗體可變區(qū)域以及全長基因測序服務。

 

圖1：雜交瘤測序

 

2.雜交瘤測序目的

雜交瘤細胞在保存過程中存在抗體基因丟失、細胞狀態(tài)不好影響抗體產生，甚至細胞死亡的情況，為將優(yōu)秀抗體長期保存、穩(wěn)定生產，可將雜交瘤細胞中的抗體基因提取并測序，最終拿到核苷酸序列，并以 DNA 形式保存，用于后期外源表達及生產。

3.雜交瘤測序應用

雜交瘤細胞抗體測序所獲取的雜交瘤細胞單克隆抗體基因序列，是發(fā)表文章或專利必須信息和重組表達工程抗體的前提之一，同時也是抗體人源化工作的基礎。

 

4.我們能夠為客戶提供高質量的雜交瘤測序服務

標準周期單克隆抗體測序服務：抗體可變區(qū)VH和VL測序、抗體VH，VL和前導區(qū)測序、全抗體VH，VL，前導區(qū)和恒定區(qū)測序，3-4周完成測序服務。

快速單克隆抗體測序服務：從目標細胞株快速識別的抗體序列，可在10天內獲得測序結果。

 

5.為客戶提供雜交瘤測序服務的全流程介紹

雜交瘤測序服務，流程包括：RNA提取，cDNA克隆，T載體構建，抗體基因測序，生物信息學分析，項目報告。

 

圖2：雜交瘤測序流程

5.1雜交瘤生產和總RNA提取
根據(jù)制造商的說明，使用TRIzol試劑從雜交瘤細胞中提取總RNA。
5.2反轉錄合成抗體可變區(qū)cDNA

5.2.1反轉錄

使用逆轉錄酶試劑盒，另外使用的是RNA樣本（來自小鼠抗體的雜交瘤RNA樣本或來自嵌合抗體RNA樣本）、引物、10 mM脫氧核苷酸三磷酸混合物（dNTPs)、H2O和80U/μLRNAse抑制劑。注意：由于其RNA含量，將模板轉換寡核苷酸分裝并儲存在–80℃。

根據(jù)以下方案執(zhí)行逆轉錄：在操作期間將所有反應保持在冰上。對于每個RNA樣品，設置三個cDNA合成反應：一個用于kappa鏈，一個用于lambda鏈，一個用于重鏈。理想情況下，每個抗體只會擴增一條輕鏈。

 

 

圖3：3H4 kappa 和 3H4 lambda 可變區(qū)的蛋白質序列比較

 

5.2.1.1 在PCR管中，準備Mix 1：2μL 50ng/μL RNA、1μL 10μM基于抗體鏈的反向RT引物（例如用于小鼠抗體的mIGKRT、mIGLRT或mIGHGRT）和1μL 10mM dNTP。對于一個RNA樣本，需要三管Mix1，每管包含不同的反向引物。

5.2.1.2 在0.5mL Eppendorf管中，配制Mix 2：1.95μL H₂O、2μL 5x SMARTScribe緩沖液、1μL 20mM DTT和0.3μL 100μM模板轉換寡核苷酸。為Mix2提供的體積用于一個cDNA合成反應，因此根據(jù)需要進行放大，即每個雜交瘤RNA樣品制備Mix 2體積的三倍。為所有反應準備了Mix 2的一種主混合物。

5.2.1.3 通過在熱循環(huán)儀中將含有Mix 1的試管在72℃下孵育3分鐘，使RNA二級結構變性。

5.2.1.4在Mix 1變性期間，將以下物質添加到Mix 2：每個cDNA合成反應0.25μL 80U/μL RNAse抑制劑和0.5μL 100U/μL SMARTScribe逆轉錄酶。

5.2.1.5 將6μL Mix 2添加到每管變性Mix 1中。

5.2.1.6在熱循環(huán)儀中，合并的混合物在42℃下孵育60分鐘，然后在70℃下孵育5分鐘終止反應。反應保持在4℃。逆轉錄后立即進行PCR擴增。不需要cDNA純化步驟。

5.2.2 抗體可變區(qū)的PCR擴增

5.2.2.1為每個cDNA合成設置PCR反應：10μL 5x PCR緩沖液，1μL 10mM dNTPs，3μL RT反應合成的cDNA，2.5μL 10μM通用正向引物ISPCR，2.5μL 10μM反向PCR引物在抗體鏈上（例如小鼠抗體的mIGKPCR、mIGLPCR或mIGHGPCR）、30.5μL H₂O和0.5μL 2U/μL Phusion聚合酶（或其他高保真聚合酶）。

5.2.2.2根據(jù)以下熱循環(huán)儀條件進行降壓/降壓PCR：98℃ 30秒；98℃ 15秒、63–57.5℃ 30秒（每個循環(huán)降低溫度0.5℃）和72℃ 30秒的10個循環(huán)；98℃ 15秒、56℃ 30秒、72℃ 30秒15個循環(huán)；隨后72℃ 7分鐘；并保持在4℃。

5.2.2.3每個RT-PCR反應取5μL在90V的TAE緩沖液中的1%瓊脂糖凝膠上運行。擴增的小鼠抗體產物出現(xiàn)在550-600個堿基對之間。擴增的人抗體產物出現(xiàn)在750-850個堿基對之間。Quick Load Purple 2-Log DNA Ladder(NEB,N0550S)用作標準品。

 

圖4：抗體可變區(qū)PCR擴增

5.3 T載體構建

使用Macherey-Nagel的PCR清理和凝膠提取試劑盒對RT-PCR反應進行PCR清理。根據(jù)平末端克隆試劑盒手冊，將2μL的每個PCR清洗的產物平末端克隆到pCR-Blunt-II-TOPO載體中。接下來，將每個TOPO克隆反應的3μL轉化為化學感受態(tài)E.Coli。將每個轉化的100μL涂布在含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，并在37℃下孵育過夜。

 

5.4 抗體基因測序

獲得菌落后，將每條抗體鏈5-10個菌落接種在5mL LB/卡那霉素培養(yǎng)基中，并在37℃下以250rpm搖動過夜。這些培養(yǎng)物使用Macherey-Nagel的小量制備試劑盒進行小量制備，所得質粒DNA由Sequetech Corporation使用M13正向引物進行Sanger測序。

 

5.5生物信息學分析

使用 GitHub 上提供的自定義 Python 程序分析測序數(shù)據(jù)，去除非功能性的DNA。

 

5.6項目報告

交付得到的抗體序列。