內毒素誘導的ECM-受體相互作用對Caco2/HT29共培養(yǎng)細胞中MUC2的影響
細菌內毒素是在革蘭氏陰性細菌的細胞壁上發(fā)現(xiàn)的有毒物質。脂多糖（LPS）是內毒素的主要有毒物質，緊密結合到其細胞壁的最外層，當細菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細胞后才釋放出來。人類胃腸道具有大量復雜的共生和有害革蘭氏陰性細菌，當腸黏膜屏障完好時，它們不會損害腸腔。然而，當腸黏膜免疫屏障受損時，許多內毒素會轉移到血液中，引起內毒素血癥。因此，確保腸黏膜屏障的完整性是防止內毒素易位的關鍵。
在腸道組織結構中，杯狀細胞分布于整個腸道，杯狀細胞能夠分泌黏蛋白（黏蛋白-2（MUC2）是腸黏液層主要成分），高度糖基化的黏蛋白分布于細胞膜或者分泌進腸腔中，形成黏液層。病原微生物必須先突破黏液層才能到達上皮細胞，因此，黏液層是腸道屏障的第一道防線，能夠保護腸道上皮細胞免受病原微生物的侵襲。先前的研究表明，在黏液層存在的情況下，內毒素不會損害腸上皮細胞。假設黏液層的缺失是由內毒素易位到腸上皮細胞引起的。然而，在沒有黏液層的情況下首先被內毒素破壞的上皮細胞的結構和功能尚不清楚。
在西北農林科技大學動物醫(yī)學院、榆林學院生命科學學院的一項聯(lián)合研究中，基于腸道屏障功能，建立了Caco-2和HT-29共培養(yǎng)細胞模型，對腸道黏液層內毒素的作用機制進行探索。此外，采用siRNA轉染分析、RNA-seq、qPCR、ELISA和免疫熒光分析評估了LPS處理后Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)的增殖、結構、功能和機制。研究結果反映了內毒素對腸黏膜屏障作用的調控機制，為深入了解腸黏膜免疫屏障功能提供了思路。相關內容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells”。
HT-29細胞常用作體外杯狀細胞模型，可產生黏蛋白分泌物，形成細胞外黏液層。Caco-2（人結腸腺癌細胞）結構和功能類似于分化的小腸上皮細胞，可以用來進行模擬體內腸轉運的實驗。研究人員選擇Caco-2和HT-29在Transwell腔室中共培養(yǎng)的組合，以確保建立的腸上皮模型具有黏液層（圖1 A）。ALPi是Caco-2細胞分化的標志物，MUC5AC是HT-29細胞分化的標志物，MUC2是形成黏液層骨架的主要成分。在15天分化過程結束時，Caco-2/HT-29（3：1）共培養(yǎng)物中的 MUC2 和 MUC5AC mRNA 表達相對于 Caco-2/HT-29 （9：1）共培養(yǎng)物中的表達顯著增加（圖1 B、C）。這些數(shù)據(jù)表明，Caco-2：HT-29 接種比率為 3：1 在腔室15 天分化結束時黏液屏障最佳。
此外，為了確認LPS的最佳時間和劑量對黏液屏障功能的影響，在Caco-2/HT-29共培養(yǎng)分化15天后，使用100、200、400、800和1000 μg/mL LPS分別在12、24、36、48小時刺激Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞。根據(jù)觀察結果，后續(xù)測試選擇400 μg/mL LPS刺激Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞。實驗還觀察到，LPS（+）組在LPS刺激12、24、36和48 小時后，與LPS（-）組相比，黏蛋白分泌顯著增加。此外，使用免疫熒光檢測，評估了不同時間點Caco-2 / HT-29共培養(yǎng)細胞中Occludin 跨膜蛋白的表達，以評估緊密連接。LPS（-）組中Caco-2/HT-29細胞在24、36和48小時具有良好的細胞膜連接性，相反，LPS（+）組細胞膜連接受損。這些結果表明，LPS（-）和LPS刺激24小時的LPS（+）組的Caco-2/HT29共培養(yǎng)細胞中的黏蛋白分泌和Occludin表達顯著增加。
圖1 建立Caco2/HT-29細胞共培養(yǎng)模型。（A）Caco-2 / HT-29共培養(yǎng)細胞模型的Transwell。（B）Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞在兩種細胞接種比例下MUC2、MUC5AC和ALPi mRNA表達。（C）兩種細胞接種比例下的Caco-2/ HT-29共培養(yǎng)細胞的圖像。
接下來，為了了解黏液層的功能，使用RNA干擾（RNAi）來沉默Caco-2/HT-2共培養(yǎng)細胞中的MUC2基因，評估MUC2 mRNA和蛋白質表達。Caco-2/ HT-29共培養(yǎng)分化15天后，在24、36、48和60小時用LPS（LPS +）或0.01M PBS （LPS-）刺激細胞。LPS（+）組和LPS（-）組MUC2 mRNA和蛋白質在24小時時的表達水平高于其他時間點。因此，Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞在LPS刺激24小時前用Lipofectamine™2000轉染siRNA MUC2構建物。這些綜合結果表明，用siRNA轉染和LPS刺激24小時后，MUC2 mRNA表達顯著增加。因此，在下面的測試中，所有共培養(yǎng)的細胞被分為三組，即LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）。
為了深入了解LPS對黏液層的調控機制，實驗使用RNA-seq技術分析了LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中的不同基因和KEGG富集途徑。在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中共發(fā)現(xiàn)了1611個上調基因和1379個差異表達基因。在LPS（-）組與 siMUC2 + LPS（+）組中分別有1417個和1904個基因上調和下調，LPS（-）組與 LPS（+）組分別有71個基因上調和82個基因下調（圖2 A）。在 LPS（-）與 siMUC2 + LPS 組和 LPS（+）與 siMUC2 + LPS 組之間共發(fā)現(xiàn)1953個差異表達基因（圖2 B）。通過KEGG富集分析測定LPS（-）與 siMUC2 + LPS 組和 LPS（+）與 siMUC2 + LPS 組的前20條信號通路（圖2 C）。利用細胞外基質（ECM）受體相互作用和黏著斑信號通路進一步研究黏液層功能機制。
圖2 LPS（+）組、LPS（-）組和siMUC2+LPS（+）組的RNA-seq。（A）LPS（+）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與LPS（+）組中不同基因的數(shù)量，紅色表示上調基因，藍色表示下調基因。（B）LPS（+）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與siMUC2+LPS（+）組、LPS（-）與LPS（+）組中不同基因簇的維恩分析。（C）LPS（+）與siMUC2+LPS（+）組（右列）和 LPS（-）與 siMUC20+LPS（+）組（左列）的 KEGG 富集分析。
最后，為了了解參與ECM-受體相互作用和黏著斑通路的不同基因，使用qPCR測量了這些因子在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中的mRNA表達。結果表明，與siMUC2 + LPS組相比，LPS（+）組Claudin-1、ZO-1、JAMA、Desmosome、Occludin和E-cadherin 的mRNA表達水平顯著升高；FN1，ITGAV，COL6A2，LAMC1，LAMA5，LAMB2，AGRN，ROCK1，ITGB2，ITGB4，ACTB-P1，CD44，ARHGAP5，HSPG2，DAG1和SRC的mRNA表達水平顯著增加。LPS（+）組和 siMUC2 +LPS（+）組之間 ITGB3、ROCK2 和 RhoA 的 mRNA 表達量無差異。
圖3 ECM受體相互作用和黏著斑信號通路的圖像。（A）腸上皮細胞黏液層結構、細胞間黏附及細胞-基質黏附。（B）ECM受體相互作用和黏著斑信號通路差異因子的相互作用機制。
總之，除了能夠建立Caco-2/HT-29模型的數(shù)據(jù)外，該研究還支持其作為評估腸道黏液屏障的有力工具的使用。在共培養(yǎng)細胞中，發(fā)現(xiàn)LPS（400 μg/ mL）刺激24小時后，可破壞MUC2基因沉默下ECM介導的黏著斑信號通路的調節(jié)機制。當黏液層不完整時，LPS首先破壞上皮細胞的緊密連接，通過ECM向下游傳遞信號調控細胞表面受體的整合素，抑制整合素介導的黏著斑結構，進一步破壞ECM網絡結構和細胞內肌動蛋白微絲骨架。最終，LPS抑制ECM和細胞骨架之間的相互作用。通過結合這些數(shù)據(jù)，黏液屏障的保護功能有望在未來得到很好的表征。
參考文獻：Hu W, Feng P, Zhang M, Tian T, Wang S, Zhao B, Li Y, Wang S, Wu C. Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells. Front Immunol. 2022 Jun 10;13:916933. doi: 10.3389/fimmu.2022.916933. PMID: 35757703; PMCID: PMC9226665.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35757703/
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在腸道組織結構中，杯狀細胞分布于整個腸道，杯狀細胞能夠分泌黏蛋白（黏蛋白-2（MUC2）是腸黏液層主要成分），高度糖基化的黏蛋白分布于細胞膜或者分泌進腸腔中，形成黏液層。病原微生物必須先突破黏液層才能到達上皮細胞，因此，黏液層是腸道屏障的第一道防線，能夠保護腸道上皮細胞免受病原微生物的侵襲。先前的研究表明，在黏液層存在的情況下，內毒素不會損害腸上皮細胞。假設黏液層的缺失是由內毒素易位到腸上皮細胞引起的。然而，在沒有黏液層的情況下首先被內毒素破壞的上皮細胞的結構和功能尚不清楚。
在西北農林科技大學動物醫(yī)學院、榆林學院生命科學學院的一項聯(lián)合研究中，基于腸道屏障功能，建立了Caco-2和HT-29共培養(yǎng)細胞模型，對腸道黏液層內毒素的作用機制進行探索。此外，采用siRNA轉染分析、RNA-seq、qPCR、ELISA和免疫熒光分析評估了LPS處理后Caco-2/HT-29細胞共培養(yǎng)的增殖、結構、功能和機制。研究結果反映了內毒素對腸黏膜屏障作用的調控機制，為深入了解腸黏膜免疫屏障功能提供了思路。相關內容發(fā)表在 Frontiers in Immunology 期刊題為“Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells”。
此外，為了確認LPS的最佳時間和劑量對黏液屏障功能的影響，在Caco-2/HT-29共培養(yǎng)分化15天后，使用100、200、400、800和1000 μg/mL LPS分別在12、24、36、48小時刺激Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞。根據(jù)觀察結果，后續(xù)測試選擇400 μg/mL LPS刺激Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞。實驗還觀察到，LPS（+）組在LPS刺激12、24、36和48 小時后，與LPS（-）組相比，黏蛋白分泌顯著增加。此外，使用免疫熒光檢測，評估了不同時間點Caco-2 / HT-29共培養(yǎng)細胞中Occludin 跨膜蛋白的表達，以評估緊密連接。LPS（-）組中Caco-2/HT-29細胞在24、36和48小時具有良好的細胞膜連接性，相反，LPS（+）組細胞膜連接受損。這些結果表明，LPS（-）和LPS刺激24小時的LPS（+）組的Caco-2/HT29共培養(yǎng)細胞中的黏蛋白分泌和Occludin表達顯著增加。
接下來，為了了解黏液層的功能，使用RNA干擾（RNAi）來沉默Caco-2/HT-2共培養(yǎng)細胞中的MUC2基因，評估MUC2 mRNA和蛋白質表達。Caco-2/ HT-29共培養(yǎng)分化15天后，在24、36、48和60小時用LPS（LPS +）或0.01M PBS （LPS-）刺激細胞。LPS（+）組和LPS（-）組MUC2 mRNA和蛋白質在24小時時的表達水平高于其他時間點。因此，Caco-2/HT-29共培養(yǎng)細胞在LPS刺激24小時前用Lipofectamine™2000轉染siRNA MUC2構建物。這些綜合結果表明，用siRNA轉染和LPS刺激24小時后，MUC2 mRNA表達顯著增加。因此，在下面的測試中，所有共培養(yǎng)的細胞被分為三組，即LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）。
為了深入了解LPS對黏液層的調控機制，實驗使用RNA-seq技術分析了LPS（-）、LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中的不同基因和KEGG富集途徑。在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中共發(fā)現(xiàn)了1611個上調基因和1379個差異表達基因。在LPS（-）組與 siMUC2 + LPS（+）組中分別有1417個和1904個基因上調和下調，LPS（-）組與 LPS（+）組分別有71個基因上調和82個基因下調（圖2 A）。在 LPS（-）與 siMUC2 + LPS 組和 LPS（+）與 siMUC2 + LPS 組之間共發(fā)現(xiàn)1953個差異表達基因（圖2 B）。通過KEGG富集分析測定LPS（-）與 siMUC2 + LPS 組和 LPS（+）與 siMUC2 + LPS 組的前20條信號通路（圖2 C）。利用細胞外基質（ECM）受體相互作用和黏著斑信號通路進一步研究黏液層功能機制。
最后，為了了解參與ECM-受體相互作用和黏著斑通路的不同基因，使用qPCR測量了這些因子在LPS（+）和siMUC2 + LPS（+）組中的mRNA表達。結果表明，與siMUC2 + LPS組相比，LPS（+）組Claudin-1、ZO-1、JAMA、Desmosome、Occludin和E-cadherin 的mRNA表達水平顯著升高；FN1，ITGAV，COL6A2，LAMC1，LAMA5，LAMB2，AGRN，ROCK1，ITGB2，ITGB4，ACTB-P1，CD44，ARHGAP5，HSPG2，DAG1和SRC的mRNA表達水平顯著增加。LPS（+）組和 siMUC2 +LPS（+）組之間 ITGB3、ROCK2 和 RhoA 的 mRNA 表達量無差異。
總之，除了能夠建立Caco-2/HT-29模型的數(shù)據(jù)外，該研究還支持其作為評估腸道黏液屏障的有力工具的使用。在共培養(yǎng)細胞中，發(fā)現(xiàn)LPS（400 μg/ mL）刺激24小時后，可破壞MUC2基因沉默下ECM介導的黏著斑信號通路的調節(jié)機制。當黏液層不完整時，LPS首先破壞上皮細胞的緊密連接，通過ECM向下游傳遞信號調控細胞表面受體的整合素，抑制整合素介導的黏著斑結構，進一步破壞ECM網絡結構和細胞內肌動蛋白微絲骨架。最終，LPS抑制ECM和細胞骨架之間的相互作用。通過結合這些數(shù)據(jù)，黏液屏障的保護功能有望在未來得到很好的表征。
參考文獻：Hu W, Feng P, Zhang M, Tian T, Wang S, Zhao B, Li Y, Wang S, Wu C. Endotoxins Induced ECM-Receptor Interaction Pathway Signal Effect on the Function of MUC2 in Caco2/HT29 Co-Culture Cells. Front Immunol. 2022 Jun 10;13:916933. doi: 10.3389/fimmu.2022.916933. PMID: 35757703; PMCID: PMC9226665.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35757703/
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