雙應激下PdL成纖維細胞中COX2/PGE2過度炎癥由抑制性三甲基化介導
表觀遺傳調控機制是牙周病發(fā)病和發(fā)展的重要危險因素。關于牙周病的炎癥方面，組蛋白尾部氨基酸的翻譯后修飾（PTMs）已被研究。組蛋白的PTMs包括乙酰化和甲基化等，它們以環(huán)境依賴性的方式調節(jié)轉錄活性。雖然組蛋白乙酰轉移酶（HATs）對乙�；母街ǔＥc染色質結構的開放和基因表達的有利環(huán)境有關，但組蛋白甲基化的影響取決于被修飾的氨基酸和這些甲基的豐度。例如，組蛋白H3（H3）第27位賴氨酸（K27）的三甲基化修飾是一類重要的轉錄抑制性翻譯后修飾，在生物進程的各個方面都發(fā)揮著重要作用。
血清長鏈脂肪酸水平升高，如飽和脂肪酸棕櫚酸（PA）通常與肥胖有關，此外，在高脂血癥條件下，PA具有促炎特征。一些研究報告了這兩種疾病之間的相互關系，例如，在喂食高脂飲食的小鼠中觀察到對革蘭陰性厭氧菌牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis）感染的延遲反應。牙齦卟啉單胞菌已被描述為影響口腔健康和疾病的關鍵病原體，可能是由于其逃避宿主免疫反應的獨特能力。
盡管這兩種疾病中的炎癥過程都增加，但它們在受到機械力（例如創(chuàng)傷、咀嚼或正畸牙齒運動期間施加的力）時對牙周膜（PdL）炎癥反應的伴隨影響仍然研究不足。PdL是牙齒和牙槽骨之間的結締組織，其最豐富的細胞是PdL成纖維細胞（PdLFs），以時間和空間方式調節(jié)對壓縮力的短暫無菌炎癥反應。
研究最近報道，PA刺激的人PdL成纖維細胞（HPdLFs）對牙齦卟啉單胞菌脂多糖（LPS）和壓縮力（2 g/cm²）的同時刺激表現(xiàn)出過度的炎癥反應，主要是通過增加前列腺素E2（PGE2）的分泌，而PGE2由環(huán)氧合酶2（COX2）調節(jié)。因此，德國耶拿大學醫(yī)院口腔正畸科、保守牙科和牙周病學系老年牙科課題組的一項研究旨在調查這種過度炎癥是否由棕櫚酸誘導的表觀遺傳改變介導。研究結果發(fā)表在 Cells 期刊題為“Palmitate-Triggered COX2/PGE2-Related Hyperinflammation in Dual-Stressed PdL Fibroblasts Is Mediated by Repressive H3K27 Trimethylation”。
為了闡明H3賴氨酸乙�；℉3Kac）在調節(jié)同時受到機械壓縮和細菌誘導的應激刺激的PA暴露HPdLFs的高炎癥反應中的作用，實驗首先檢查了相關H3Kac調節(jié)因子（圖1 a、b），其與PdL特性、牙周病和高脂血癥有關。這些基因包括編碼組蛋白乙酰轉移酶（HATs）CREB結合蛋白（CBP），E1A結合蛋白p300（p300），賴氨酸乙酰轉移酶8（KAT8）和核受體共激活因子3（NCOA3），以及編碼組蛋白去乙酰化相關蛋白的基因，例如組蛋白去乙�；�1（HDAC1），HDAC2，HDAC3和對HDAC活性很重要的蛋白質，例如SIN3轉錄調節(jié)因子家族成員A（SIN3A）。
然而，定量表達分析顯示，在PA處理下，無論是在編碼HATs的基因（圖1 a）還是HDACs 或 SIN3A的基因（圖1 b），都沒有生物學上相關的顯著差異。因此，通過免疫熒光泛染色分析了H3K9/14/18/23/27ac（H3Kac）（圖1 c、d），結果檢測到，施加壓縮力后H3K乙�；皆黾樱欢�，由于PA暴露，沒有觀察到差異，這表明在這些條件下PA對H3Kac的影響相當小。
圖1 棕櫚酸對受牙齦假單胞菌LPS刺激的壓縮下HPdLFs中的H3Kac沒有影響。
考慮到PA也可以影響組蛋白甲基化的抑制形式，例如H3K27三甲基化（H3K27me3），接下來研究了這種修飾的改變是否有助于引發(fā)過度的炎癥應激反應。實驗對編碼多梳抑制復合物2（PRC2）核心成分的基因進行了定量PCR，該基因對PdL功能很重要，包含EZH2及其高度相關的同源物EZH1、胚胎外胚層發(fā)育的抑制子（EED）、zeste 12的抑制子（SUZ12）。
數(shù)據顯示，無論是壓縮力還是脂肪酸暴露，均未檢測到基因表達的相關變化（圖2 a）。然而，PRC2的活性和特異性被證明受到核心成分的翻譯后修飾的調節(jié)。因此，用定量免疫熒光分析了雙刺激下HPdLFs中H3K27三甲基化水平（圖2 b、c），發(fā)現(xiàn)施加額外的壓縮力導致H3K27me3水平降低，然而，與對照組（82.68%±3.66）相比，PA培養(yǎng)組的變化（62.17%±4.24）明顯較低。這說明，棕櫚酸影響LPS 刺激的HPdLFs中壓縮力誘導的H3K27me3降低。
隨后研究了雙應激PA培養(yǎng)中相應H3K27特異性組蛋白甲基轉移酶（HMTs）活性的變化是否可能導致H3K27me3水平的改變，發(fā)現(xiàn)HMT活性在施加壓縮力時降低，同樣，在PA處理的HPdLFs中，這種趨勢明顯較弱。
為了評估H3K27三甲基化和HMT活性的這些微小變化是否與PA在雙刺激HPdLFs中的促炎作用有關，實驗用UNC1999抑制了PRC2、EZH1和EZH2的核心酶。濃度為1.00 μM 的UNC1999處理HPdLFs 后發(fā)現(xiàn)，H3K27相關組蛋白甲基轉移酶（HMTs）的活性降低至23.23%±2.56%，盡管較低的抑制劑濃度也導致HMT活性的強烈抑制。
為了驗證1.00 μM UNC1999對雙應激下PA培養(yǎng)物中H3K27三甲基化的抑制作用，分析了HMT活性，在BSA對照和PA培養(yǎng)中，UNC1999處理導致HMT活性降低，證實了其在實驗環(huán)境中的抑制作用。因此，與BSA對照相比，PA處理的HPdLFs對H3K27特異性HMT表現(xiàn)出相當?shù)幕钚浴?br />
為了說明炎癥過程，對單核細胞THP1細胞進行了粘附實驗，與BSA對照相比，PA暴露導致雙重刺激下HPdLFs的炎癥反應增強。雖然UNC1999介導的EZH1和EZH2活性降低不會改變雙刺激下BSA對照中貼壁THP1細胞的數(shù)量，但它將PA培養(yǎng)物中單核細胞的過度活化降低到與BSA對照相當?shù)乃健?br />
為了進一步研究UNC1999對炎癥過程的影響，實驗確定了COX2的表達，它似乎與PA誘導的雙重刺激下HPdLFs的過度炎癥反應有關。分析顯示，PA培養(yǎng)物中的COX2表達顯著高于BSA對照，這種上調的COX2轉錄被UNC1999抑制。為了確認COX2水平改變對相關細胞因子分泌的潛在影響，分析了雙刺激下HPdLFs加UNC1999處理后上清中分泌的PGE2水平，結果支持先前在COX2表達背景下提出的假設，即雙重刺激PA培養(yǎng)中PGE2的過量分泌被UNC1999所減弱。
總之，這些數(shù)據表明，雙重刺激下PA培養(yǎng)物中H3K27me3的減少通過改變HMT活性可能導致HPdLFs的過度炎癥反應，這可能是通過COX2/PGE2調節(jié)。
最后，實驗研究了編碼抗炎細胞因子白細胞介素10（IL-10，圖3 a），已被證明可以調節(jié)COX2轉錄，其表達可能受到組蛋白修飾中脂肪酸依賴性變化的影響，發(fā)現(xiàn)在雙刺激PA培養(yǎng)物中檢測到IL10轉錄顯著降低。
為了驗證抑制H3K27三甲基化對IL10基因活性的影響，對與H3K27me3結合的DNA片段進行了染色質免疫沉淀。分析顯示，在暴露于PA的雙應激HPdLFs中，這種抑制組蛋白標記在兩個IL10啟動子相關側（#1和#3）的水平增加（圖3 b、c）。H3K27me3與IL10啟動子位點（#1和#3）的增強關聯(lián)被使用UNC1999而抑制的EZH1和EHZ2所抵消，結果與BSA對照相似（圖3 b、c）�？傊c三甲基化H3K27的增強關聯(lián)可能是PA處理雙應激下HPdLFs中IL10表達降低的潛在原因，而IL10表達降低又可能導致這些條件下COX2/PGE信號傳導增強。
組蛋白的高度動態(tài)表觀遺傳修飾可以調節(jié)基因表達，以響應各種環(huán)境線索。該研究首次表明，肥胖相關的高脂血癥狀態(tài)可以通過影響其炎癥反應的機械力影響細菌刺激的成纖維細胞中啟動的表觀遺傳變化。因此，棕櫚酸相關的對牙齦卟啉單胞菌LPS刺激的壓縮下人PdLFs細胞的高炎癥反應似乎是通過增強COX2抑制因子IL-10基因啟動子附近的H3K27三甲基化而下調實現(xiàn)的。獲得的結果強烈表明，代謝相關的變化在表觀遺傳調控中起著核心作用，這些調控是由致病性和機械應力引起的軟硬組織重塑，為未來的靶向治療提供了有希望的潛力。
參考文獻：Schuldt L, Reimann M, von Brandenstein K, Steinmetz J, Döding A, Schulze-Späte U, Jacobs C, Symmank J. Palmitate-Triggered COX2/PGE2-Related Hyperinflammation in Dual-Stressed PdL Fibroblasts Is Mediated by Repressive H3K27 Trimethylation. Cells. 2022 Mar 10;11(6):955. doi: 10.3390/cells11060955. PMID: 35326406; PMCID: PMC8946768.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35326406/
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盡管這兩種疾病中的炎癥過程都增加，但它們在受到機械力（例如創(chuàng)傷、咀嚼或正畸牙齒運動期間施加的力）時對牙周膜（PdL）炎癥反應的伴隨影響仍然研究不足。PdL是牙齒和牙槽骨之間的結締組織，其最豐富的細胞是PdL成纖維細胞（PdLFs），以時間和空間方式調節(jié)對壓縮力的短暫無菌炎癥反應。
研究最近報道，PA刺激的人PdL成纖維細胞（HPdLFs）對牙齦卟啉單胞菌脂多糖（LPS）和壓縮力（2 g/cm²）的同時刺激表現(xiàn)出過度的炎癥反應，主要是通過增加前列腺素E2（PGE2）的分泌，而PGE2由環(huán)氧合酶2（COX2）調節(jié)。因此，德國耶拿大學醫(yī)院口腔正畸科、保守牙科和牙周病學系老年牙科課題組的一項研究旨在調查這種過度炎癥是否由棕櫚酸誘導的表觀遺傳改變介導。研究結果發(fā)表在 Cells 期刊題為“Palmitate-Triggered COX2/PGE2-Related Hyperinflammation in Dual-Stressed PdL Fibroblasts Is Mediated by Repressive H3K27 Trimethylation”。
為了闡明H3賴氨酸乙�；℉3Kac）在調節(jié)同時受到機械壓縮和細菌誘導的應激刺激的PA暴露HPdLFs的高炎癥反應中的作用，實驗首先檢查了相關H3Kac調節(jié)因子（圖1 a、b），其與PdL特性、牙周病和高脂血癥有關。這些基因包括編碼組蛋白乙酰轉移酶（HATs）CREB結合蛋白（CBP），E1A結合蛋白p300（p300），賴氨酸乙酰轉移酶8（KAT8）和核受體共激活因子3（NCOA3），以及編碼組蛋白去乙酰化相關蛋白的基因，例如組蛋白去乙�；�1（HDAC1），HDAC2，HDAC3和對HDAC活性很重要的蛋白質，例如SIN3轉錄調節(jié)因子家族成員A（SIN3A）。
然而，定量表達分析顯示，在PA處理下，無論是在編碼HATs的基因（圖1 a）還是HDACs 或 SIN3A的基因（圖1 b），都沒有生物學上相關的顯著差異。因此，通過免疫熒光泛染色分析了H3K9/14/18/23/27ac（H3Kac）（圖1 c、d），結果檢測到，施加壓縮力后H3K乙�；皆黾樱欢�，由于PA暴露，沒有觀察到差異，這表明在這些條件下PA對H3Kac的影響相當小。
圖1 棕櫚酸對受牙齦假單胞菌LPS刺激的壓縮下HPdLFs中的H3Kac沒有影響。
考慮到PA也可以影響組蛋白甲基化的抑制形式，例如H3K27三甲基化（H3K27me3），接下來研究了這種修飾的改變是否有助于引發(fā)過度的炎癥應激反應。實驗對編碼多梳抑制復合物2（PRC2）核心成分的基因進行了定量PCR，該基因對PdL功能很重要，包含EZH2及其高度相關的同源物EZH1、胚胎外胚層發(fā)育的抑制子（EED）、zeste 12的抑制子（SUZ12）。
數(shù)據顯示，無論是壓縮力還是脂肪酸暴露，均未檢測到基因表達的相關變化（圖2 a）。然而，PRC2的活性和特異性被證明受到核心成分的翻譯后修飾的調節(jié)。因此，用定量免疫熒光分析了雙刺激下HPdLFs中H3K27三甲基化水平（圖2 b、c），發(fā)現(xiàn)施加額外的壓縮力導致H3K27me3水平降低，然而，與對照組（82.68%±3.66）相比，PA培養(yǎng)組的變化（62.17%±4.24）明顯較低。這說明，棕櫚酸影響LPS 刺激的HPdLFs中壓縮力誘導的H3K27me3降低。
圖2 在PA 暴露的HPdLFs中，K27三甲基化對雙重刺激的反應較小。
隨后研究了雙應激PA培養(yǎng)中相應H3K27特異性組蛋白甲基轉移酶（HMTs）活性的變化是否可能導致H3K27me3水平的改變，發(fā)現(xiàn)HMT活性在施加壓縮力時降低，同樣，在PA處理的HPdLFs中，這種趨勢明顯較弱。
為了評估H3K27三甲基化和HMT活性的這些微小變化是否與PA在雙刺激HPdLFs中的促炎作用有關，實驗用UNC1999抑制了PRC2、EZH1和EZH2的核心酶。濃度為1.00 μM 的UNC1999處理HPdLFs 后發(fā)現(xiàn)，H3K27相關組蛋白甲基轉移酶（HMTs）的活性降低至23.23%±2.56%，盡管較低的抑制劑濃度也導致HMT活性的強烈抑制。
為了驗證1.00 μM UNC1999對雙應激下PA培養(yǎng)物中H3K27三甲基化的抑制作用，分析了HMT活性，在BSA對照和PA培養(yǎng)中，UNC1999處理導致HMT活性降低，證實了其在實驗環(huán)境中的抑制作用。因此，與BSA對照相比，PA處理的HPdLFs對H3K27特異性HMT表現(xiàn)出相當?shù)幕钚浴?br />
為了說明炎癥過程，對單核細胞THP1細胞進行了粘附實驗，與BSA對照相比，PA暴露導致雙重刺激下HPdLFs的炎癥反應增強。雖然UNC1999介導的EZH1和EZH2活性降低不會改變雙刺激下BSA對照中貼壁THP1細胞的數(shù)量，但它將PA培養(yǎng)物中單核細胞的過度活化降低到與BSA對照相當?shù)乃健?br />
為了進一步研究UNC1999對炎癥過程的影響，實驗確定了COX2的表達，它似乎與PA誘導的雙重刺激下HPdLFs的過度炎癥反應有關。分析顯示，PA培養(yǎng)物中的COX2表達顯著高于BSA對照，這種上調的COX2轉錄被UNC1999抑制。為了確認COX2水平改變對相關細胞因子分泌的潛在影響，分析了雙刺激下HPdLFs加UNC1999處理后上清中分泌的PGE2水平，結果支持先前在COX2表達背景下提出的假設，即雙重刺激PA培養(yǎng)中PGE2的過量分泌被UNC1999所減弱。
總之，這些數(shù)據表明，雙重刺激下PA培養(yǎng)物中H3K27me3的減少通過改變HMT活性可能導致HPdLFs的過度炎癥反應，這可能是通過COX2/PGE2調節(jié)。
最后，實驗研究了編碼抗炎細胞因子白細胞介素10（IL-10，圖3 a），已被證明可以調節(jié)COX2轉錄，其表達可能受到組蛋白修飾中脂肪酸依賴性變化的影響，發(fā)現(xiàn)在雙刺激PA培養(yǎng)物中檢測到IL10轉錄顯著降低。
為了驗證抑制H3K27三甲基化對IL10基因活性的影響，對與H3K27me3結合的DNA片段進行了染色質免疫沉淀。分析顯示，在暴露于PA的雙應激HPdLFs中，這種抑制組蛋白標記在兩個IL10啟動子相關側（#1和#3）的水平增加（圖3 b、c）。H3K27me3與IL10啟動子位點（#1和#3）的增強關聯(lián)被使用UNC1999而抑制的EZH1和EHZ2所抵消，結果與BSA對照相似（圖3 b、c）�？傊c三甲基化H3K27的增強關聯(lián)可能是PA處理雙應激下HPdLFs中IL10表達降低的潛在原因，而IL10表達降低又可能導致這些條件下COX2/PGE信號傳導增強。
圖3 雙應激下HPdLFs暴露于棕櫚酸導致IL10啟動子區(qū)域附近H3K27三甲基化降低，與IL10表達降低相關。
圖4 圖形概要
組蛋白的高度動態(tài)表觀遺傳修飾可以調節(jié)基因表達，以響應各種環(huán)境線索。該研究首次表明，肥胖相關的高脂血癥狀態(tài)可以通過影響其炎癥反應的機械力影響細菌刺激的成纖維細胞中啟動的表觀遺傳變化。因此，棕櫚酸相關的對牙齦卟啉單胞菌LPS刺激的壓縮下人PdLFs細胞的高炎癥反應似乎是通過增強COX2抑制因子IL-10基因啟動子附近的H3K27三甲基化而下調實現(xiàn)的。獲得的結果強烈表明，代謝相關的變化在表觀遺傳調控中起著核心作用，這些調控是由致病性和機械應力引起的軟硬組織重塑，為未來的靶向治療提供了有希望的潛力。
參考文獻：Schuldt L, Reimann M, von Brandenstein K, Steinmetz J, Döding A, Schulze-Späte U, Jacobs C, Symmank J. Palmitate-Triggered COX2/PGE2-Related Hyperinflammation in Dual-Stressed PdL Fibroblasts Is Mediated by Repressive H3K27 Trimethylation. Cells. 2022 Mar 10;11(6):955. doi: 10.3390/cells11060955. PMID: 35326406; PMCID: PMC8946768.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35326406/
小編旨在分享、學習、交流生物科學等領域的研究進展。如有侵權或引文不當請聯(lián)系小編修正。如有任何的想法以及建議，歡迎聯(lián)系小編。感謝各位的瀏覽以及關注！
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