通過機械或藥物刺激激活 TRPV4 阻斷 IL-1β介導的關節(jié)軟骨基質破壞

骨關節(jié)炎（OA）是最常見的慢性關節(jié)疾病。軟骨的健康是通過對機械刺激的響應來維持的，壓縮或拉伸應變形式的機械負荷在軟骨細胞中具有抗炎作用，并阻斷促炎介質一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的釋放，以響應白細胞介素-1β（IL-1β）。炎癥信號傳導導致OA中的軟骨退化，因此了解機械負荷與炎癥之間的聯(lián)系會對治療產生重大的影響。

瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（TRPV4）是一種Ca²⁺ 可滲透的非選擇性陽離子通道，在關節(jié)軟骨細胞中高度表達，并被機械刺激激活。TRPV4 是軟骨細胞和其他細胞類型機械轉導所必需的，它介導促合成代謝和抗分解代謝基因的調控，促進軟骨中細胞的增殖和基質的產生，而這兩者都會影響關節(jié)的生長。TRPV4 定位于質膜和初級纖毛。初級纖毛參與了軟骨細胞機械傳導和炎癥信號傳導。研究已經報道了機械負荷通過與鞭毛內運輸（IFT）/纖毛改變相關的組蛋白脫乙�；�酶6（HDAC6）激活與來抵消炎癥信號，以響應促炎細胞因子白細胞介素1β（IL-1β）。TRPV4 在該途徑中的作用尚未確定。

基于此，在英國倫敦瑪麗女王大學工程與材料科學學院研究團隊的一項實驗中，首次證明了通過循環(huán)拉伸應變（CTS）、低滲透刺激或 TRPV4 選擇性激活劑GSK1016790A 激活 TRPV4 可抑制促炎性 IL-1β 信號傳導和與初級纖毛伸長改變相關的軟骨降解。因此，TRPV4 可能為治療關節(jié)疾病和其他炎癥病變提供新的靶點。相關內容發(fā)表在Osteoarthritis AND Cartilage 期刊題為“Activation of TRPV4 by mechanical, osmotic or pharmaceutical stimulation is anti-inflammatory blocking IL-1β mediated articular cartilage matrix destruction”。

首先，IL-1β 處理（1-10 ng/ml濃度，24h）導致 NO 和 PGE2 的顯著劑量依賴性釋放，而CTS（0.33 Hz，0-10% 應變，24 h）形式的機械載荷顯著降低了這種反應。IL-1β誘導的NO釋放被CTS消除，因此1或10 ng/ml均無統(tǒng)計學意義，CTS在1 ng/ml IL-1β濃度下完全抑制PGE2的釋放，但在10 ng/ml濃度下僅部分抑制PGE2的釋放。用TRPV4拮抗劑GSK205（10μM）同時處理可消除機械負荷的抗炎作用。此外，GSK205 在有或沒有 IL-1β 的無負載細胞中對 NO 或 PGE2 釋放沒有影響，但在有 IL-1β 的負載細胞中 IL-1β 效應可被恢復，NO 和PGE2 釋放均被IL-1β顯著提高。無論是否存在 CTS，IL-1β 和 GSK205 處理均不影響 TRPV4 蛋白水平。這些數據表明，機械負荷的抗炎作用是由 TRPV4 激活介導的。

接下來，實驗將分離的軟骨細胞用高滲透壓培養(yǎng)基（400 mOsm）、低滲透壓培養(yǎng)基（200 mOsm）或等滲透壓培養(yǎng)基（315 mOsm）處理24小時（圖1 A、B）。結果表明，無論是否存在IL-1β ，與等滲對照相比，高滲透刺激對NO釋放沒有顯著影響，而低滲透刺激顯著減弱了IL-1β（1 ng/ml）的促炎反應，使得24 h時NO釋放的增加顯著降低（圖1 A），但對細胞活力沒有明顯影響（圖1 B）。在GSK205存在下，完全抑制了低滲透刺激對IL-1β誘導的NO釋放的抗炎作用，使得NO釋放的效果與對照條件沒有顯著差異（圖1 A）。

在軟骨外植體中，低滲透刺激顯著降低了 IL-1β 誘導的 NO 釋放（圖1 C），而且阻斷了IL-1β介導的sGAG釋放，表明細胞外基質降解減少。在整個實驗過程中，軟骨細胞活力保持不變（圖1 D）。與分離的細胞一致，在存在或不存在 1 ng/ml IL-1β 的情況下，高滲透刺激對 NO 或 sGAG 釋放沒有影響。GSK205 處理恢復了低滲透介質中 IL-1β 誘導的 NO 釋放從而阻斷滲透激發(fā)的抗炎作用（圖1 C）。有趣的是，GSK205 進一步增加了 IL-1β 誘導的 NO 在等滲對照培養(yǎng)基中的釋放，這在分離細胞中未見（圖1 C）。這些數據共同表明，低滲透壓負荷的抗炎作用也是由 TRPV4 激活介導的。

圖1 低滲透刺激在分離的軟骨細胞和軟骨外植體中通過 TRPV4 依賴性途徑抑制 IL-1β 介導的 NO 釋放。

IL-1β 誘導關節(jié)軟骨細胞中的初級纖毛伸長，并通過調節(jié) IFT 介導下游分解代謝 NF-κB 信號傳導。因此，實驗研究了初級纖毛在TRPV4激活的抗炎機制中的參與。在分離的軟骨細胞中觀察到 TRPV4 纖毛定位，通過機械負荷、低滲透刺激或GSK101（1 nM）激活 TRPV4 會增加 TRPV4 纖毛定位，但對蛋白質表達沒有顯著影響。這些數據提示了 IFT 的改變。

在分離的軟骨細胞中，IL-1β（1ng / ml）處理24h可誘導初級纖毛長度從中位數2.21-2.84 μm顯著增加，而GSK101 激活 TRPV4 而消除這種效應。IL-1β介導的纖毛伸長也被機械負荷（CTS，0-10%，0.33 Hz） 和低滲透刺激阻斷。GSK205抑制TRPV4恢復了IL-1β介導的纖毛在機械負荷和低滲透刺激下的伸長。這些數據表明，TRPV4激活與初級纖毛定位改變有關并調節(jié)纖毛長度。

然后，實驗研究了 TRPV4 的直接藥物激活是否會復制機械和滲透負荷的抗炎作用。IL-1β （1 ng/ml）誘導離體軟骨細胞中NO和PGE2釋放的特征性上調，而GSK101可以消除這種上調（圖2 A、B）。同樣，IL-1β 誘導的 COX2 表達被 GSK101 消除（圖2 C）。

此前，已經確定了 HDAC6 激活和轉錄后微管蛋白修飾在機械負荷抗炎作用中的機制作用。同樣，GSK101 導致 HDAC6 活性顯著上調（圖2 D），表明 TRPV4 介導的鈣信號激活 HDAC6。與這一發(fā)現一致，實驗觀察到顯著的微管蛋白去乙�；�，伴隨著非聚合的可溶性微管蛋白池的減少（圖2 E-F）。此外，HDAC6 特異性抑制劑 Tubacin（500 nM）恢復了 IL-1β 介導的 GSK101 處理細胞中 NO 的釋放（圖2 G）。這些數據表明，GSK101 模擬了機械負荷對 IL-1β 炎癥信號傳導、HDAC6 激活和微管蛋白修飾的影響。

圖2 TRPV4 激活通過 HDAC6 激活消除 IL-1β 炎癥信號傳導。

最后，實驗確定了TRPV4的藥物激活是否可以防止軟骨退化和機械性能的喪失，將軟骨外植體在1nM或10nM GSK101存在下用IL-1β處理12天。在IL-1β處理下，觀察到顯著的NO釋放（圖3 A），表明炎癥信號的激活。這種反應伴隨隨顯著的 sGAG 釋放，表明軟骨退化（圖3 B）。

然后使用單軸無側限壓縮測量軟骨組織的粘彈性，以確定 GSK101 是否可以防止 IL-1β 引起的機械性能喪失。軟骨外植體呈現出以切線模量為15-20 MPa的非線性應力-應變曲線（圖3 C）。隨后在20% 應變下粘彈性應力松弛（圖3 D），在300秒下松弛模量為2-3 MPa，代表80%的松弛，松弛半衰期約為50秒（圖3 E-H）。IL-1β處理導致機械剛度急劇下降，如切線模量（圖3 E）和松弛模量（圖3 F）的顯著降低，松弛百分比增加（圖3 G）和半衰期減少（圖3 H）。

GSK10顯著抑制IL-1β處理后軟骨外植體NO的累積釋放（圖3 A）。同樣，sGAG的累積釋放也顯著減少，并且響應IL-1β的機械性能喪失被消除，因此在有和沒有IL-1β的情況下，任何生物力學參數都沒有顯著差異。這些數據表明，TRPV4 激活消除了 IL-1β 介導的軟骨退化和機械性能喪失。

圖3 TRPV4 激活抑制 IL-1β 誘導的軟骨外植體中 NO 釋放、基質降解和機械性能喪失。

總之，該研究證明了 TRPV4 激活在負荷下的抗炎機制中的作用。除了為該通路提供新的機制理解外，該研究還將 TRPV4 確定為潛在的治療靶點，并證明該蛋白的藥物激活可以調節(jié)炎癥和其他涉及軟骨疾病的 IFT 依賴性通路。

參考文獻：Fu S, Meng H, Inamdar S, Das B, Gupta H, Wang W, Thompson CL, Knight MM. Activation of TRPV4 by mechanical, osmotic or pharmaceutical stimulation is anti-inflammatory blocking IL-1β mediated articular cartilage matrix destruction. Osteoarthritis Cartilage. 2021 Jan;29(1):89-99. doi: 10.1016/j.joca.2020.08.002. PMID: 33395574; PMCID: PMC7799379.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33395574/

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