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一文了解如何使用酶標儀獲得更好的數據

瀏覽次數：3616　發(fā)布日期：2024-1-10　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

在生命科學研究領域，酶標儀是一種應用廣泛的實驗室儀器，可測量化學、生物或物理過程。通過將光信號（吸光度、熒光或化學發(fā)光）轉化為讀數，酶標儀支持研究人員進行多種生物學分析。

從實驗室的基礎研究到藥物發(fā)現和開發(fā)，再到診斷等應用，酶標儀具有強大的檢測能力。

那么如何讓您的酶標儀發(fā)揮最佳性能，獲得可靠、準確的數據呢？以下為您放送5個小貼士。

優(yōu)化增益設置

酶標儀的測量范圍指的是可測量的最強和最弱信號之間的范圍，“增益”是影響此范圍的主要參數。高增益可大幅放大光信號，適用于產生信號較弱的樣品。低增益對信號的放大程度較小，適用于產生信號較強的樣品。增益設定取決于具體的檢測方法。增益設置過高可能會導致讀數飽和并失去準確性；增益設置過低可能導致低水平信號檢測效果不佳（圖1）。要找到理想的增益值，沒有放之四海而皆準的答案，但可以遵循一些通用準則：

避免信號飽和

避免使信號強度超過酶標儀的動態(tài)范圍。如果出現過飽和，會導致超出范圍的信號被剪切，或導致額外信號損失。

優(yōu)化信噪比

選擇的增益值應最/大/程度地增強信號，并降低背景噪音。過高的增益會放大信號，同時也可能放大噪音。找到合適的平衡點至關重要，這將有助于優(yōu)化信噪比。

使用校準和標準曲線

使用一系列已知濃度的樣品建立標準曲線，可以得出需要測量可靠信號的濃度范圍，有助于確定儀器所需的最佳增益設置。

保持一致性

一旦找到能夠提供可靠、一致結果的增益值，應盡量在相關實驗中使用相同的設置，這將有助于確保結果的可再現性。

遵循制造商的建議

酶標儀制造商會為具體的測定或分析法的提供相應的指導建議，該資料是增益調節(jié)的實用參考。

對于BMG LABTECH酶標儀的建議是，增益調節(jié)初始設置的目標值為樣品孔預計產生最強信號的90%。在動力學測定等應用中，信號隨時間而變化，則建議初始將目標值設定為空白樣品的10%。另外，比較先進的酶標儀具有自動增益調節(jié)功能。CLARIOstar® Plus和VANTAstar® 配備的動態(tài)范圍擴展技術 (EDR) 可提供8個數量級濃度的動態(tài)范圍，無需手動調節(jié)增益。

圖1：某酶標儀的動態(tài)范圍

注意閃光次數的影響

熒光或吸光度測量數據的可靠性和準確性與激發(fā)樣品的閃光次數有關，需要了解閃光次數對測量產生的影響（圖2）。

圖2：用于熒光檢測的光源和探測系統(tǒng)

一個關鍵點是閃光次數與測量時間之間的權衡。酶標儀進行測量所需的時間會隨著閃光次數的增加而增加。對于動力學應用，測量數據點之間的時間間隔極短，多次閃光會顯著增加測量時間。

當應用對速度有要求時，容易傾向于選擇較少的閃光次數。但酶標儀可以得出多個數據點的平均值。使用的閃光次數越多，每次閃光之間的差異就越小。

雖然較多的閃光次數有助于提高測量的統(tǒng)計可靠性，但不建議每次測量都使用盡可能多的閃光次數，這樣會增加測量時間，而且與使用較少閃光次數的測量相比，并不一定能明顯改善數據質量。對于多數檢測應用，10-50次閃光是夠用的。某些特定的應用可能需要更多的閃光次數。

總之，為一項檢測選擇適當的閃光次數，有助于保持較低的變異系數 (%CV) 和標準差，從而確保數據的可靠性和準確性。

找到理想的焦距

焦距是指酶標儀的探測系統(tǒng)與微孔板中樣品之間的距離。最佳對焦位置是酶標儀能檢測到樣品最高信號強度的平面。

了解樣品的性質

不同的樣品需要不同的焦距來獲取樣品的最佳信號強度。例如，貼壁細胞樣品會在微孔板的孔底形成細胞層，接近孔底部的焦距可獲得最高的信號強度。先進的酶標儀可在測量前進行焦距調整，自動識別某個樣品或某組樣品的最佳焦距（圖3）。

圖3：某酶標儀的焦距曲線

了解微孔板類型

如果使用的微孔板類型不同，同一樣品的最佳焦距也會有所不同。比如孔底分不同形狀，如果是圓形的，孔內每個位置的液體深度和局部環(huán)境都略有不同。因此，相同的樣品在不同形狀的微孔板中可能會產生不同的焦距。不同材料或不同孔密度（如96/384/1536）的微孔板也可能需要不同的焦距高度。微孔板底座的高低也會有影響。

注意加液體積的影響

樣品的加液體積會影響焦距，在操作中應確保一致性。如果加液體積出現差異，無論是無意為之還是出于其他原因，都會影響結果的可靠性。各孔之間就算相差幾微升，也會使測量結果出現較大偏差。

降低自發(fā)熒光

基于細胞的分析法（CBA）是生命科學研究不可或缺的工具。在這方面通常會遇到的一個挑戰(zhàn)是自發(fā)熒光，即生物物質自然發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光通常來自細胞培養(yǎng)基或細胞本身的成分。

生化檢測通常在純水或成分簡單的緩沖溶液中進行，自發(fā)熒光可以忽略不計。但CBA通常需要額外的生物成分，如血清或氨基酸，來為細胞提供營養(yǎng)。這些額外成分會增加自發(fā)熒光。細胞也會因其成分而產生自發(fā)熒光。細胞中天然存在的熒光團通常會在光譜的藍綠區(qū)發(fā)出熒光，在考慮規(guī)避其自發(fā)熒光特性的解決方案時需要考慮到這一點（圖 4）。

圖4：導致細胞自發(fā)熒光的細胞內成分的熒光發(fā)射光譜。

那么，在酶標儀上進行CBA檢測時，應采取哪些措施才能獲得可靠、準確的數據呢？

緩沖液的選擇

建議選擇自發(fā)熒光較低的緩沖液，如磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)，可大程度提高信噪比。應盡量避免在培養(yǎng)基中使用酚紅等分子，并盡可能減少血清等補充營養(yǎng)物的用量。對于熒光測量，可考慮使用FluoroBrite™ 等培養(yǎng)基，其自發(fā)熒光水平較低，是PBS的良好替代品。

光學元件的選擇

如果可選，建議使用底部光學元件進行CBA的測量。這樣可以避免光線穿過細胞上方的上清液。如果研究的是貼壁細胞，底部光學元件可確保樣品發(fā)出更好的信號，并減少懸浮細胞的培養(yǎng)基可能產生的自發(fā)熒光。

熒光團的選擇

如果可選，應使用紅移染料進行檢測，以避免細胞成分產生自發(fā)熒光。紅移染料在波長較大的區(qū)域發(fā)射，可避免探測到藍綠區(qū)域。天然細胞熒光團的自發(fā)熒光通常會在藍綠區(qū)域產生干擾，在光譜的紅色區(qū)域進行測量有助于減少這些天然熒光團產生的背景熒光。

降低異質樣品的數據變異性

在使用酶標儀進行測量時，降低不必要的數據變異性非常重要。在CBA應用中，細胞通常以非均質的方式生長。這對數據的準確性和可靠性帶來了挑戰(zhàn)。有些酶標儀只從孔的中心讀取一個讀數，由于細胞在整個孔中分布不均勻，這個讀數可能無法反映樣品的全貌。在這種情況下，建議在多點采集信號，以降低數據變異性。以螺旋、軌道或矩陣模式捕獲信號的酶標儀可確保更精確的測量（圖5）。這不僅適用于貼壁細胞等非均質樣品，也適用于聚集的細菌和酵母。