蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡的常見(jiàn)問(wèn)題及其解決方案

蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡 (Western blot，簡(jiǎn)稱(chēng) WB) 是一種常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室方法，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)并評(píng)估其表達(dá)水平。根據(jù)其分子量和與特定抗體的免疫反應(yīng)性來(lái)鑒定感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)印跡由一系列相互關(guān)聯(lián)的步驟組成 (圖 1)[1]。

圖 1. 蛋白質(zhì)印跡相互關(guān)聯(lián)的步驟^[1]。 

 (1) 將樣品 (通常是蛋白質(zhì)混合物) 加載到凝膠上。Marker 標(biāo)記包含各種已知分子量的預(yù)標(biāo)記蛋白質(zhì)，與蛋白質(zhì)樣品一起加載到凝膠上作為尺寸參考。(2) 凝膠電泳用于根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量來(lái)分離蛋白質(zhì)。(3) 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移或“印跡”到膜上。(4) 封閉膜以減少非特異性結(jié)合，然后依次用特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白的一抗和二抗進(jìn)行探測(cè)。后者結(jié)合一抗并攜帶允許隨后檢測(cè)的酶或熒光團(tuán)。(5) 分別通過(guò)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)或熒光檢測(cè)信號(hào)。(6) 準(zhǔn)備蛋白質(zhì)印跡圖像以供發(fā)表。

由于該實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、細(xì)節(jié)多，從樣品制備到顯影，每個(gè)步驟中都可能存在問(wèn)題，最后得到的條帶往往千奇百怪、不盡人意……在這篇推文中，我們將為您介紹一些常見(jiàn)的 WB 實(shí)驗(yàn)問(wèn)題以及相應(yīng)的解決方案[2]。小 M 助您避免實(shí)驗(yàn)中的各種困擾，快來(lái)看看吧！

▐ 1. 微笑條帶：

可能性原因：遷移過(guò)快、電泳緩沖液溫度偏高、蛋白質(zhì)超載或孔內(nèi)運(yùn)行緩沖液不足。

建議：應(yīng)降低遷移速度、預(yù)冷緩沖液、減少蛋白上樣量、緩沖液完全覆蓋孔，確保內(nèi)室緩沖液不會(huì)泄露到外室[4][6]。

▐ 2. 皺眉條帶：

▐ 3. 條帶拖尾：

▐ 4. 啞鈴狀不均勻條帶：

建議：重新配置膠，確保膠質(zhì)量無(wú)問(wèn)題來(lái)避免該現(xiàn)象出現(xiàn)；在樣品使用前離心。

▐ 5. 條帶粘連：

建議：可通過(guò)減少上樣量和提高配膠質(zhì)量來(lái)避免。

▐ 6. 條帶空泡：

建議：確保在組裝“三明治”時(shí)，移除凝膠和印跡膜間的所有氣泡。

▐ 7. 背景有不均勻的黑色斑點(diǎn)：

建議：封閉液一定要充分溶解，封閉結(jié)束之后要用 TBST 清洗三遍再加一抗；抗體孵育時(shí)保持搖動(dòng)。

▐ 8. 條帶空斑：

建議：可減少蛋白上樣量；降低一抗和二抗?jié)舛龋换蛘呦♂岋@影液。

通過(guò)本篇推文介紹，相信普通的難題已經(jīng)難不倒你們了! 如果以上內(nèi)容沒(méi)有解決您的問(wèn)題，歡迎大家在下方留言，小 M 歡迎大家積極交流實(shí)驗(yàn)中遇到的各種疑難問(wèn)題~