細胞消化法介紹及消化過程中的常見問題分析

相信很多細胞培養(yǎng)實驗的同學(xué)對細胞消化做了許多研究，實驗室的師兄師姐們也得出了很多有價值的經(jīng)驗，同時也遇到很多人的困惑。在這里結(jié)合各位實驗專家和自己的經(jīng)驗，介紹一些細胞消化基本操作知識和注意事項，如果不足之處，歡迎補充討論。

 

我們在細胞培養(yǎng)時大部會以貼壁的形式生長（除了取自血、脾或骨髓的細胞），使用的完全培養(yǎng)基中的血清，含有許多帶陽性電荷的促細胞附著因子（層黏連蛋白 Laminine、纖維鏈接蛋白 Fibronectin 等胞外基質(zhì)），能幫助細胞附著于帶陰性電荷的底物上，并形成鍵結(jié)、貼壁伸展。也就是所謂的～細胞消化Cell Detachment

 

 

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常見細胞消化法

常見細胞消化法有三種　

機械消化法、離子螯合法、酶消化法　

 

一 、機械消化法

直接用液體吹打或用刮刀，施予外力讓細胞與培養(yǎng)底物分離；適用于貼壁性弱的細胞傳代，但相較于其它消化方法，這種外力無法量化控制，細胞分散效果差，且可能會造成大量細胞破損，使內(nèi)容物釋放到培養(yǎng)基，進而影響細胞傳代狀態(tài)。
 

▲細胞刮勺

 

二 、離子螯合法

細胞膜表面蛋白大多需要鈣、鎂離子來維持與胞外基質(zhì)的穩(wěn)定鍵結(jié)，當然也包含各種黏附蛋白（例：整合素、鈣黏著蛋白、橋粒等），螯合劑會在不破壞細胞膜表面蛋白的狀況下，抽離這些離子，使黏附蛋白失活而減少細胞-細胞間及細胞-底物間的連接作用，讓細胞較容易在施予外力時，脫離培養(yǎng)底物并促進細胞分散。

0.02% EDTA是細胞傳代最常用的離子螯合劑，在37℃作用效果最佳（消化較敏感的細胞可在4℃作用），適用于消化一般貼壁性細胞或細胞表面標記實驗細胞。

 

但EDTA無法用血清終止其反應(yīng)，所以在消化細胞后必須用緩沖鹽溶液（如：PBS）清洗離心，以免影響后續(xù)細胞貼盤效果。

▲ EDTA（黑）能螯合二價離子（紅）

 

三 、酶消化法

用蛋白水解酶消化連接細胞及培養(yǎng)底物的蛋白質(zhì)，適用于消化貼壁性稍強的細胞。

 

上述實驗方法中最常見的還是胰酶消化。大部分細胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可，但是我們發(fā)現(xiàn)吸去胰蛋白酶后，殘留的那些附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2分鐘足夠消化細胞（絕大部分1分鐘不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是先采用PBS潤洗細胞吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化細胞。

 

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什么程度算消化完全呢？

所謂消化并不是細胞全部分散分布形成單個圓形才算消化完好，一般我們?nèi)庋塾^察貼壁細胞表層，只要能漂浮移動了，多半呈沙粒狀漂浮移動，其實已經(jīng)可以了。說明細胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。細胞就是完全成單個細胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細胞，尤其是腫瘤細胞的一個特性。

 

細胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個時候即使是成片的（比如Calu-3細胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個視細胞而定。如果和標準形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至完全吹打成單細胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。

 

如果遇到比較難消化的細胞（潤洗方法5min還不能消化），就以colon cancer為例，比如HCT15, LS411和KM12，這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足夠了。即使這樣難消化的細胞，一般不超過5min，即可見細胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細胞也會有難消化的時候，比如tsDC細胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

 

針對消化時間和細胞類型、消化液的消化能力、細胞的密度等多種因素有關(guān)。一般養(yǎng)一種新的細胞要摸索一下消化時間，掌握細胞消化到什么程度恰到好處。新配的消化液消化能力較強，配好后可分裝成小管，一次用完，其余凍在-20℃，以保持酶活力。細胞生長到覆蓋70～80％瓶底時消化較好，若細胞密度過大則消化后細胞易成團。

 

我們常規(guī)的細胞實驗（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細胞例外），受消化影響不是很大。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細胞代數(shù)，對細胞狀態(tài)要求極高。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細胞包裝能力就會逐漸下降（當然也有其它因素影響包裝效率）。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

 

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細胞消化的時候需用胰酶潤洗一遍

吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細胞表面的微量胰酶在37℃一般不到2min足夠消化細胞（絕大部分1min不到）。對于這些細胞原則上不要用胰酶孵育細胞，連續(xù)這樣傳代，對細胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37℃消化。比較難消化的細胞（潤洗方法5min還不能消化），這樣的細胞一般需要用少量胰酶孵育。

 

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消化的影響

常規(guī)的細胞實驗（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化（難消化細胞例外）即可。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細胞代數(shù)，對細胞狀態(tài)要求極高。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細胞包裝能力就會逐漸下降（當然也有其它因素影響包裝效率）。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

 

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EDTA的作用

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負責粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不徹底的話），而應(yīng)該想其它辦法。

 

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PBS洗滌注意事項

消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。但這里面也有學(xué)問可以講，對于一些難消化細胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制trypsin的活性。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細胞，不需要配制如此溶液。

 

來源:細胞之邦

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