spheroONE球狀組織分選在自動化和高度可重復(fù)的3D細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
CELLENION* UPM
將GrowDex®和spheroONE結(jié)合以實現(xiàn)自動化和高度可重復(fù)的3D細胞培養(yǎng)工作流程
摘要
本應(yīng)用說明展示了spheroONE和GrowDex®的兼容性,用于自動化3D細胞培養(yǎng)工作流程。
spheroONE是一款納升級細胞分選儀,可以分選和分離球形細胞和器官組織。GrowDex® 是一種植物提取的納米纖維素 (NFC) 水凝膠,為培養(yǎng)各種類型的細胞提供有效的3D基質(zhì)。在這項工作中,研究人員證明,在這種納米纖維素基質(zhì)中播種的單個 HepG2 細胞可以無縫地培育出大量 HepG2 球形樣本。隨后,spheroONE可用于自動分配GrowDex®到微孔板中,以便對單個HepG2球體進行分選、分離和嵌入,為后續(xù)的篩選應(yīng)用準備高度可重復(fù)的檢測就緒微孔板。
介紹
近年來，人們對3D模型的興趣激增，這是因為它們與傳統(tǒng)的2D模型相比更具有生理學的相關(guān)性。這些3D模型表現(xiàn)出獨特的特征，如空間結(jié)構(gòu)、擴散阻隔、獨特的基因表達模式和耐藥性。它們已成為再生醫(yī)學研究和抗腫瘤藥物篩選的首選。我們的研究提供了一個專門針對HepG2球體的解決方案。該模型應(yīng)用廣泛，包括肝病建模（非酒精性脂肪肝、肝癌、病毒性肝炎）、肝毒性評估以及了解藥物在生理環(huán)境下對肝細胞的影響。HepG2 球形細胞還有助于肝臟代謝、酶活性和基因表達分析，揭示各種肝臟相關(guān)疾病的復(fù)雜分子機制。確保使用3D模型進行可重復(fù)的高通量篩選取決于基于大小和形態(tài)選擇高度均勻的球體群體。這種均勻性是可靠和可重復(fù)實驗的基礎(chǔ)，需要適當?shù)呐囵B(yǎng)基質(zhì)來保證球形體的持續(xù)生長和活力，從而實現(xiàn)長期篩選。為此，我們推出了一種將先進的spheroONE技術(shù)與GrowDex®的優(yōu)質(zhì)特性相結(jié)合的解決方案。
SpheroONE是一種創(chuàng)新型儀器，專為分離和分選球形體、腫瘤細胞和器官組織等大顆粒而設(shè)計。它的自動化功能簡化了工作流程并提高了效率。此外，它還能精確分配緩沖液和培養(yǎng)基，是一種適用于多種應(yīng)用的多功能工具。
另一方面，GrowDex® 水凝膠是不含動物成分的植物提取納米纖維素 (NFC) 水凝膠，可為培養(yǎng)各種類型的細胞提供有效的3D基質(zhì)。GrowDex 類似于人體的細胞外基質(zhì)，支持細胞生長，并使分子易于擴散。GrowDex® 與自動化兼容，不需要特殊的處理和儲存條件，易于操作，因此非常適合各種基于3D細胞的篩選應(yīng)用。先進的SpheroONE技術(shù)與成熟的GrowDex®之間的共生協(xié)同效應(yīng)在3D細胞培養(yǎng)和篩選領(lǐng)域樹立了新的標準，為研究人員提供了一個強大而多功能工具，以促進他們的研究并加速科學發(fā)現(xiàn)。
方法與結(jié)果
A. 在GrowDex® 中形成HepG2球形細胞：
HepG2細胞在完整培養(yǎng)基中傳統(tǒng)單層培養(yǎng)4天。通過將GrowDex®原液（1.5% w/v）與完整培養(yǎng)基稀釋，制備GrowDex® 工作溶液（0.5% w/v）。收獲 HepG2 細胞,并以 10^5 cells/mL 的濃度將其重新懸浮在GrowDex® 工作溶液
（0.5%w/v）中。將懸浮在GrowDex®中的細胞移液至96孔底平底ULA板的每個孔中（100 µL/孔）,結(jié)果每孔約有 10,000 個細胞。隨后，用移液管將完全培養(yǎng)基移入每個孔（100 µL/孔）,置于細胞負載的 GrowDex® 層之上（圖 1）。最后,將微孔板置于標準細胞培養(yǎng)條件下（37°C,5%CO2）培養(yǎng) 5 天，得到 HepG2 球形細胞。
圖1. 在GrowDex®中高通量形成HepG2球體的過程。
a. HepG2 細胞的2D培養(yǎng)。 b. 收獲細胞并將其重新懸浮在用培養(yǎng)基稀釋的 GrowDex® 中。c. 將 100µL HepG2 細胞培養(yǎng)在 GrowDex® 中的每個孔中并加入100µL細胞培養(yǎng)基。d. 培養(yǎng) 5 天后在 GrowDex® 中形成 HepG2 球形細胞。
培養(yǎng)5天后,每孔產(chǎn)生約1400個HepG2 小球。顯微鏡成像顯示了直徑約為50至130微米的異質(zhì)球體群。
B.使用spheroONE進行GrowDex®配液：spheroONE能夠自動分配各種溶液和試劑（粘度高達22.5 mPa*s，如70%甘油溶液）。spheroONE 由一個加壓儲液器、一個電磁閥和一個小孔徑噴嘴組成,可實現(xiàn)高精度的納升級按需滴加。通過控制滴液體積和點滴次數(shù),它為微孔板的每個孔提供了一種通用解決方案,可重復(fù)地填充納升至微升級別的溶液體積。
在這項研究中,SpheroONE 成功地將 GrowDex® 0.5% w/v 自動分配到 384 ULA 板（15 µL/孔）中。使用 600 µm納米噴點毛細管（NDC 600）噴點水凝膠,閥門參數(shù)如下:壓力為 mBar，啟動時間為 1500 ms。使用SpheroONE進行自動孔預(yù)填充大大方便了微孔板制備，并顯著減少了氣泡的形成，而氣泡的形成通常會阻礙手動移液的微孔板制備。
C.使用spheroONE分離HepG2球形顆粒：
借助spheroONE的光學系統(tǒng)（包括高分辨率攝像頭、暗場照明模塊）和玻璃 NDC，它能夠檢測、分析、排序和分離直徑在50至600范圍內(nèi)的顆粒。當顆粒沉降減少時，使用spheroONE進行顆粒的分離和回收效果大大提高。在這項研究中，將球狀體在GrowDex®中重新懸浮，顯著減輕了顆粒的沉降，從而大大提高了回收和分離效率。
在球形體分離當天,將GrowDex® 中的100µL 球形體培養(yǎng)物（在 A 部分中制備）重懸于2mLPBS 中,以獲得GrowDex® 0.025%w/v中約700個球狀體/mL的最終濃度。隨后將該樣品放入spheroONE的儲液器中,并與預(yù)填充的384 ULA 板（在 B 部分中制備）一起安裝在spheroONE內(nèi)。
spheroONE安裝了NDC 300（直徑 300 μm），并設(shè)置了以下閥門參數(shù):壓力為200mBar,啟動時間為 10 ms。檢測和分離參數(shù)設(shè)置如下表1所示。
圖2. 使用spheroONE 對HepG2 球體進行排序和隔離。
a. 暗視野圖像展示一個球體（直徑99 微米,長徑比：1.68）。b. 顯微鏡圖像展示在384 ULA 板孔內(nèi)分離的一個球體。c. 散點圖表示實驗期間檢測到的球體,綠色表示分離的球體,黃色表示由于NDC 中存在多個顆粒而未分離的球體，粉色表示不符合分離標準的球體。
在 384 ULA 板的每個孔中,單個 HepG2 球形體被成功分離到預(yù)填充的 GrowDex® 層上（圖 2）。然后使用spheroONE進行另外兩個試劑分配步驟：每個孔中再加入 15 µl 0.5% w/v 的 GrowDex® 以完全包埋球形體；最后，在包埋的 HepG2 球形體上分配 25µl 完全培養(yǎng)基,以獲得可用于進一步培養(yǎng)和/或篩選的平板。
研究結(jié)論
這項研究成功證明了 GrowDex® 和 spheroONE 在3D細胞培養(yǎng)實驗微孔板制備自動化和標準化方面的協(xié)同作用。第一步展示了使用 GrowDex® 在單個 96 孔 ULA 板中高通量形成 10 萬多個 HepG2 球形細胞的優(yōu)勢。在第二步中，SpheroONE 被用作試劑分配器，在 384 孔 ULA 板的每個孔中預(yù)先填充一層 GrowDex®。隨后，用SpheroONE裝入HepG2球形體, 然后在384孔ULA板內(nèi)對單個球體進行排序和分離。最后,用 spheroONE 再分裝一層 GrowDex®，將每個小球完全包埋，并在頂部加入培養(yǎng)基（圖3）,以獲得可用于進一步實驗或篩選應(yīng)用的微孔板。
這一工作流程的主要優(yōu)勢在于其簡化的自動化操作，通過使用spheroONE既能將規(guī)定體積的 GrowDex®（和試劑）精確分配到預(yù)定義的目標平板中，又能高精度地排序和分離單個球體。
這種創(chuàng)新方法展示了在 GrowDex® 中高效率和高通量準備球體的成本效益，然后在準備好的實驗板中自動準備具有單個球體的統(tǒng)一孔位，這將對高度可重復(fù)的3D細胞培養(yǎng)實驗產(chǎn)生重要影響。
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