使用Ghost cytometry進行高通量細胞表型的池式CRISPR篩選的過程介紹

CRISPR基因編輯池式篩選是一種使用CRISPR基因編輯技術進行高通量基因篩選的方法。該方法靈活且高效，能夠在單次實驗中同時對成千上萬的基因進行編輯，為研究者在生物醫(yī)學研究領域提供了強大的工具。

CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是細菌或古菌的一種免疫機制，能夠幫助它們抵抗病毒等外源遺傳物質的入侵。在2012年，科學家發(fā)現(xiàn)了其在基因編輯上的潛力，他們利用CRISPR關聯(lián)蛋白（Cas）能夠被引導至任何DNA序列并精確剪切，實現(xiàn)了目標基因的定向編輯。

池式篩選，即在一個大的“池子”里，每個細胞攜帶一個不同的基因編輯工具-指導RNA（gRNA）。這種編輯工具可以引導Cas蛋白至特定的基因進行編輯。在CRISPR池式篩選中，研究者可以使用含有數(shù)以千計不同gRNA的質粒庫對大量細胞進行轉染，使每個細胞內(nèi)接收到一個隨機的gRNA。

傳統(tǒng)的基因篩選方法通常會對單個基因或一小組基因進行逐個測試，這種做法比較耗時且效率較低。某些篩選方法，例如通過微生物菌落挑選或表達差異分析等，雖然可以同時處理多個樣品，但是每個基因通常都需要單獨處理和分析。
 

而“池式篩選”方法則是一種高通量篩選技術。在一個“池子”中，每個細胞被賦予一個特定的基因編輯工具，比如CRISPR的gRNA，就形成了一個大規(guī)�；�因編輯池。然后，通過對整個細胞池進行外部壓力處理，可以一次性篩選出許多對生存或生長有影響的基因。這樣就可以在單個實驗中對全基因組進行篩選，大大提高了篩選效率。

文章的介紹部分詳述了基于CRISPR的池式篩選方法的幾個優(yōu)勢，包括提高通量，降低成本，減少了不同篩選中出現(xiàn)的批次效應。在池式的表型篩選中，細胞和細胞內(nèi)分子被標記為熒光染料、報告基因或熒光免疫抗體。因為需要量化明確定義的特征，所以基于熒光的標記由于其對目標分子的高特異性和高靈敏度具有明顯的優(yōu)勢。例如，在熒光激活細胞分類（FACS）中，從時間信號中測量的代表性值，如總熒光，或從光學顯微圖像中評估的更詳細的特性，如分子定位和形態(tài)參數(shù)。

然而，當適用的生物標志物或染色方法不可用，能否在用識別特征的圖像分析評估細胞表型變得具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個挑戰(zhàn)，基于機器學習的無標記高內(nèi)容細胞表型分析成為一個有希望的替代方案。

在這項研究中，作者展示了一種用于大規(guī)模池化CRISPR篩選的多功能方法，包括熒光和無標記高內(nèi)容細胞表型，利用基于熒光和無標簽Ghost Cytometry（GC）技術的細胞分類器。

首先，細胞表達Cas9蛋白被用池化CRISPR逆轉錄病毒庫轉導以實現(xiàn)功能喪失基因集，并選出穩(wěn)定病毒整合。隨后，經(jīng)化合物或試劑處理的池化敲除細胞庫顯示出多種表型。如有必要，可以進行額外的試驗，例如免疫染色。在GC-based的細胞分選中，預訓練的機器學習模型可以選擇性地豐富顯示目標高內(nèi)容表型的細胞。最后，可以將篩選的細胞進行各種生物學試驗，包括基因分析如基因組測序，蛋白質試驗以及基于細胞的功能性分析。在標準CRISPR擾動篩選中，從篩選細胞中提取基因組DNA，并由PCR擴增sgRNA區(qū)域，然后利用商業(yè)上可得的下一代測序平臺閱讀，以確定導致目標表型的基因。當篩選活細胞時，單細胞RNA測序的轉錄組學分析和基于細胞的功能試驗是廣泛適用的。

所以，整體來看，這種方法結合了CRISPR基因編輯技術，無標簽高內(nèi)容篩選和機器學習，進一步提高了我們對基因功能和表型的理解，以及我們在生物醫(yī)學研究中的篩選能力。