MST技術(shù)在分子層面揭示免疫增效子PcrIIC1的作用
01 研究背景
CRISPR系統(tǒng)是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可保護宿主細胞免受外來DNA的入侵。作為噬菌體和細菌免疫系統(tǒng)之間持續(xù)斗爭的一部分，CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)進化成各種類型，每種類型都具有不同的功能。Cas9蛋白通過向?qū)NA（sgRNA）切割外源DNA的免疫特性被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。II型Cas9是這些系統(tǒng)中研究最廣泛的，具有多種亞型。目前尚不確定該家族成員是否能進化出額外的機制來對抗病毒入侵。
本期文獻，研究者們通過前期鑒定大量基因及蛋白預(yù)測工作，揭示了II-C型Cas9的三個結(jié)構(gòu)生長軌跡，進而發(fā)現(xiàn)了Chrysobacterium物種的CbCas9會與CRISPR–Cas系統(tǒng)促進（pro-CRISPR）蛋白（PcrIIC1）形成異源四聚體復(fù)合物。驗證PcrIIC1能夠作為一種CRISPR免疫增效子。作者借助MST技術(shù)直接在分子層面直觀揭示了PcrIIC1免疫增效子的增強效果，降低實驗設(shè)計難度，節(jié)省大量成本和時間。
02 研究內(nèi)容
2024年5月29日，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 課題組聯(lián)合北京大學(xué)生命學(xué)院白洋課題組和清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來課題組在 Nature 雜志在線發(fā)表了題為“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究論文。
研究者鑒定了2062個完整的Cas9基因座，預(yù)測出相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，并揭示了II-C型Cas9的三個結(jié)構(gòu)生長軌跡。研究者發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因（NAG）往往存在于較大的II-C Cas9的基因座中。通過生化實驗和冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明，來自金黃色細菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長出了一個全新的增強Cas9活性的β-REC2結(jié)構(gòu)域，以及一個全新的能夠與其關(guān)聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結(jié)構(gòu)域。通過蛋白間相互作用，2個CbCas9蛋白和2個PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復(fù)合物。這意味著PcrIIC1可以在整個CRISPR防御過程中與CbCas9結(jié)合。
為什么PcrIIC1要和Cas9結(jié)合呢？研究者通過MST實驗直觀地揭曉了答案。
MST實驗顯示PcrIIC1和apo-CbCas9之間具有中等的結(jié)合親和力（Kd=2.56±0.28μM）（圖1a）。值得注意的是，PcrIIC1和CbCas9–sgRNA之間的結(jié)合親和力增加到334±120 nM的Kd值，PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之間的結(jié)合親和性增加到275±86 nM（28 bp）（圖1b，c），表明sgRNA表達可能作為天然宿主中異源四聚體組裝的檢查點。（CRISPR免疫防御系統(tǒng)是通過Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合來切割外源DNA來實現(xiàn)的，這個特性也被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。）
圖1. MST和冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結(jié)合的三個階段
CbCas9與PcrIIC1結(jié)合后復(fù)合物有什么作用，為什么說PcrIIC1是免疫增效子呢？
MST實驗也給出了直觀的答案。與單獨的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強的DNA結(jié)合（圖2a）進而體現(xiàn)出切割活性，對原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強，抗噬菌體免疫性增強。
圖2. PcrIIC1增強CbCas9的DNA結(jié)合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯配容忍 (e) 能力
*圖片來源https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/5848.htm
最后，為了檢驗CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進行了抗噬菌體實驗。實驗結(jié)果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統(tǒng)對噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會導(dǎo)致增強的免疫力喪失。以上結(jié)果說明CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體的形成對整個CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強至關(guān)重要。
03 技術(shù)優(yōu)勢
本研究利用MST技術(shù)在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。對于分子互作親和力的檢測，Monolith系列儀器不依賴于分子量變化，蛋白用量少，是一種在溶液狀態(tài)下表征分子互作的技術(shù)。對于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)蛋白與蛋白互作的真實情況。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物后，進一步的功能探究，如蛋白復(fù)合物與核酸的相互作用，通過Monolith系列儀器進行的實驗設(shè)計更為簡便，能夠直觀地展示相互作用的結(jié)果，從而凸顯您研究的分子功能。
CRISPR系統(tǒng)是在原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可保護宿主細胞免受外來DNA的入侵。作為噬菌體和細菌免疫系統(tǒng)之間持續(xù)斗爭的一部分，CRISPR系統(tǒng)已經(jīng)進化成各種類型，每種類型都具有不同的功能。Cas9蛋白通過向?qū)NA（sgRNA）切割外源DNA的免疫特性被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。II型Cas9是這些系統(tǒng)中研究最廣泛的，具有多種亞型。目前尚不確定該家族成員是否能進化出額外的機制來對抗病毒入侵。
本期文獻，研究者們通過前期鑒定大量基因及蛋白預(yù)測工作，揭示了II-C型Cas9的三個結(jié)構(gòu)生長軌跡，進而發(fā)現(xiàn)了Chrysobacterium物種的CbCas9會與CRISPR–Cas系統(tǒng)促進（pro-CRISPR）蛋白（PcrIIC1）形成異源四聚體復(fù)合物。驗證PcrIIC1能夠作為一種CRISPR免疫增效子。作者借助MST技術(shù)直接在分子層面直觀揭示了PcrIIC1免疫增效子的增強效果，降低實驗設(shè)計難度，節(jié)省大量成本和時間。
02 研究內(nèi)容
2024年5月29日，清華大學(xué)生命學(xué)院劉俊杰 (Jun-Jie Gogo Liu) 課題組聯(lián)合北京大學(xué)生命學(xué)院白洋課題組和清華大學(xué)生命學(xué)院陳春來課題組在 Nature 雜志在線發(fā)表了題為“Pro-CRISPR PcrIIC1-associated Cas9 system for enhanced bacterial immunity” 的研究論文。
研究者鑒定了2062個完整的Cas9基因座，預(yù)測出相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)，并揭示了II-C型Cas9的三個結(jié)構(gòu)生長軌跡。研究者發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因（NAG）往往存在于較大的II-C Cas9的基因座中。通過生化實驗和冷凍電鏡解析復(fù)合體結(jié)構(gòu)表明，來自金黃色細菌屬（Chryseobacterium sp.）的CbCas9生長出了一個全新的增強Cas9活性的β-REC2結(jié)構(gòu)域，以及一個全新的能夠與其關(guān)聯(lián)基因PcrIIC1互作的CTH結(jié)構(gòu)域。通過蛋白間相互作用，2個CbCas9蛋白和2個PcrIIC1蛋白能夠形成異源四聚體復(fù)合物。這意味著PcrIIC1可以在整個CRISPR防御過程中與CbCas9結(jié)合。
為什么PcrIIC1要和Cas9結(jié)合呢？研究者通過MST實驗直觀地揭曉了答案。
MST實驗顯示PcrIIC1和apo-CbCas9之間具有中等的結(jié)合親和力（Kd=2.56±0.28μM）（圖1a）。值得注意的是，PcrIIC1和CbCas9–sgRNA之間的結(jié)合親和力增加到334±120 nM的Kd值，PcrIIC1和Cb Cas9–sgRNA–dsDNA之間的結(jié)合親和性增加到275±86 nM（28 bp）（圖1b，c），表明sgRNA表達可能作為天然宿主中異源四聚體組裝的檢查點。（CRISPR免疫防御系統(tǒng)是通過Cas9蛋白與sgRNA結(jié)合來切割外源DNA來實現(xiàn)的，這個特性也被廣泛研究和應(yīng)用到基因編輯領(lǐng)域。）
圖1. MST和冷凍電鏡分析CbCas9和PcrIIC1結(jié)合的三個階段
CbCas9與PcrIIC1結(jié)合后復(fù)合物有什么作用，為什么說PcrIIC1是免疫增效子呢？
MST實驗也給出了直觀的答案。與單獨的CbCas9相比，CbCas9-PcrIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強的DNA結(jié)合（圖2a）進而體現(xiàn)出切割活性，對原間隔區(qū)相鄰基序序列的兼容性更廣，對錯配的耐受性更強，抗噬菌體免疫性增強。
圖2. PcrIIC1增強CbCas9的DNA結(jié)合(a)、切割(b)、PAM兼容性(c)、DNA解旋 (d) 和錯配容忍 (e) 能力
*圖片來源https://life.tsinghua.edu.cn/info/1131/5848.htm
最后，為了檢驗CRISPR免疫增效子PcrIIC1對CbCas9抗噬菌體免疫能力的影響，研究人員在大腸桿菌中進行了抗噬菌體實驗。實驗結(jié)果表明PcrIIC1顯著提升CbCas9系統(tǒng)對噬菌體的抵抗，且如果破壞CbCas9與PcrIIC1的相互作用，會導(dǎo)致增強的免疫力喪失。以上結(jié)果說明CbCas9-PcrIIC1復(fù)合體的形成對整個CRISPR-Cas系統(tǒng)的免疫增強至關(guān)重要。
03 技術(shù)優(yōu)勢
本研究利用MST技術(shù)在分子層面直觀的揭示了免疫增效子PcrIIC1的作用。對于分子互作親和力的檢測，Monolith系列儀器不依賴于分子量變化，蛋白用量少，是一種在溶液狀態(tài)下表征分子互作的技術(shù)。對于蛋白可能需要形成多聚體，在溶液環(huán)境下，更能有效的體現(xiàn)蛋白與蛋白互作的真實情況。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形成復(fù)合物后，進一步的功能探究，如蛋白復(fù)合物與核酸的相互作用，通過Monolith系列儀器進行的實驗設(shè)計更為簡便，能夠直觀地展示相互作用的結(jié)果，從而凸顯您研究的分子功能。
Monolith分子互作檢測儀
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分子互作
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