甲砜霉素檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）使用說明書

1、 原理及用途
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測畜禽組織、蜂蜜、雞蛋樣本中的甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP），試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物、抗體、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的甲砜霉素藥物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗甲砜霉素藥物抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含甲砜霉素藥物含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中甲砜霉素藥物的殘留量。

2、 技術(shù)指標(biāo)
2.1 試劑盒靈敏度：0.5ppb(ng/ml)
2.2 反應(yīng)模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
組織、蜂蜜……………………………0.25ppb
雞蛋……………………………………1ppb
2.4 交叉反應(yīng)率：
甲砜霉素………………………………100%
氟苯尼考………………………………36.4%
氯霉素…………………………………308%
 2.5 樣本回收率：
組織……………………………………85%±20%
蜂蜜……………………………………85%±25%
雞蛋……………………………………85%±25%

3、 試劑盒組成
酶標(biāo)板……………………………96孔
標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml
0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb…………1ml
酶標(biāo)記物（紅蓋） …………………5.5ml
抗體工作液（藍(lán)蓋） ………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
2×復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個

4、 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：乙酸乙酯、正己烷、乙腈

5、 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：復(fù)溶液
將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×復(fù)溶液加1份去離子水），用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液2:工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
配液3：乙腈-水溶液
    V乙腈:V水=84:16
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 組織樣本處理方法 
1）稱取均質(zhì)后的樣本3±0.05g于50ml離心管中，加入6ml乙酸乙酯振蕩5分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取上層液體4ml在50-60℃下氮氣吹干；
3）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，震蕩均勻,再加入1ml復(fù)溶液，混合1分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相50μl進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.25ppb
5.3.2 蜂蜜樣本處理方法
1）取2±0.05g蜂蜜于離心管中，用4ml去離子水溶解，加入4ml乙酸乙酯振蕩2分鐘，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取上層液體2ml在50-60℃下氮氣吹干；
3）用0.5ml復(fù)溶液溶解干燥的殘渣，混勻；
4）取50μl進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：0.5    檢測下限：0.25ppb
5.3.3 蛋類樣本處理方法
1）取3±0.05g均質(zhì)的蛋類樣本于50ml離心管中，加9ml乙腈-水溶液振蕩混合2分鐘，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
2）取上層液體3ml于另一離心管中，加入3ml去離子水，再加4.5ml乙酸乙酯振蕩1分鐘，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
3）取全部上層液體在50-60℃下氮氣吹干；
4）用1ml正己烷溶解干燥的殘渣，再加入2ml復(fù)溶液，混合30秒，室溫4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘；
4）去除上層有機相，取下層水相50μl進行分析。
樣本稀釋倍數(shù)：2    檢測下限：1ppb

6、 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，加抗體工作液50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光反應(yīng)30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干。（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍(lán)色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。
6.7 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。
6.8 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成。

7、 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝	A	×100%
	A0

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�

8、 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9、 貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。