NOX2誘導(dǎo)生成的ROS和PITX2在肥胖介導(dǎo)的房顫中發(fā)揮的作用

3. 抑制 Nox2 的表達(dá)使心房 APD 正�；瘡亩�逆轉(zhuǎn)肥胖介導(dǎo)的房顫
為了評估 Nox2 缺失對心房心肌細(xì)胞的電生理學(xué)影響，分別檢測四組小鼠心房心肌細(xì)胞的電生理變化。結(jié)果表明，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠的心房 AP 時程延長、最大 AP 振幅（APAmax）和上升速度（dV/dTmax）均顯著升高。此外，DIO Nox2-KO 小鼠的心房 AP 與對照組和 Nox2-KO 小鼠非常相似，3 組間的 APD20、APD50、APD90、APAmax、dV/dTmax 均無變化。

4. DIO Nox2-KO 小鼠通過調(diào)節(jié) I_Na 和 I_Ks 來恢復(fù) APD
為了確定抑制 NOX2 蛋白表達(dá)對心房 I_Na 的影響，對 4 組小鼠進(jìn)行了全細(xì)胞膜片鉗檢測，結(jié)果證明，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠的峰值 I_Na 密度顯著增加，在所有測試電位下 I_Na 密度均恢復(fù)，與對照小鼠和 Nox2-KO 小鼠相似。此外，DIO Nox2-KO 和 DIO-Apocynin 小鼠中 Na_v 1.5 蛋白表達(dá)也顯著增加。已知 Nox2 的增加導(dǎo)致 PKC 亞型蛋白的表達(dá)增加從而下調(diào) Na_v 1.5 的表達(dá)最終抑制 I_Na。由此，對對照組、DIO、Nox2-KO 和 DIO Nox2-KO 小鼠進(jìn)行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示，敲除 Nox2 逆轉(zhuǎn)了肥胖誘導(dǎo)的 PKC-α 和 PKC-δ 亞型蛋白表達(dá)的增加。

與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠在 30 mV 和 50 mV 時的 I_Ks 密度顯著降低。DIO Nox2-KO 小鼠 K_v 7.1 和 MinK 蛋白表達(dá)降低，但 K_v 1.5 主要鉀通道保持不變。DIO Nox2-KO 小鼠顯示編碼 I_Ks 的 Kcnq1、Kcne1 和編碼 I_Kur 的 Kcna5 的 mRNA 表達(dá)減少。最后，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠中 Kcnj3（乙酰膽堿活化鉀通道（I_KACh）的一部分）的表達(dá)顯著降低。之前的研究表明，心房利鈉肽（ANP）活性的增加可以調(diào)節(jié)含有 NPPA 突變的 hiPSC-aCMs 中的 I_Ks。與對照組相比，DIO 小鼠 ANP mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增加，而在 DIO Nox2-KO 小鼠中表達(dá)被抑制。

圖2. DIO Nox2-KO 小鼠顯示出心房動作電位的增加和肥胖誘導(dǎo)的離子通道重構(gòu)的消除

5. 抑制 NOX2 的表達(dá)改善了 DIO 小鼠心房心肌細(xì)胞和 PA 處理的 hiPSC-aCMs 的收縮性
I_Ca,L 密度的降低是 DIO 小鼠心房電重構(gòu)的一個標(biāo)志。I_Ca,L 的減少抑制了肌漿網(wǎng)（SR）的鈣釋放和整體心房的收縮力。為了進(jìn)一步評估這一變化，應(yīng)用膜片鉗技術(shù)分別對四組小鼠心房心肌細(xì)胞進(jìn)行 I_Ca,L 的檢測，并使用熒光鈣染料 Fura-2 進(jìn)行鈣瞬變檢測。實驗結(jié)果表明，在 DIO Nox2-KO 小鼠中，I_Ca,L 減少得到了顯著緩解并且 Ca²⁺ 濃度高于 DIO 小鼠心房細(xì)胞，說明 DIO Nox2- KO 小鼠肌漿網(wǎng)鈣釋放量的增加。與對照組和 DIO Nox2-KO 組小鼠心房細(xì)胞相比，DIO 組小鼠心房細(xì)胞肌節(jié)的縮短得到顯著抑制。

圖3. NOX2 抑制可改善 DIO 小鼠的心房收縮力

6. 使用 NOX2 小分子抑制劑能夠抑制 PA 處理的 hiPSC-aCMs 中 NOX2 的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了肥胖誘導(dǎo)的離子通道重構(gòu)
流式細(xì)胞計數(shù)法結(jié)果顯示，與 DMSO 處理的細(xì)胞相比，視黃酸處理的細(xì)胞中表達(dá) K_v 1.5 的細(xì)胞百分比顯著增加，而表達(dá)心室標(biāo)記物 MLC2v 的細(xì)胞百分比顯著下降。為了探究 NOX2 在介導(dǎo)脂肪酸（FA）誘導(dǎo)的心房重構(gòu)中的作用，本實驗選用 PA 和 NOX2 小分子抑制劑 GSK-2795039（20μM，PA-GSK-hiPSC-aCMs）和油酸（OA）處理 5 天。熒光標(biāo)測技術(shù)結(jié)果表明與 PA 處理的 hiPSC-aCMs 相比，PA-GSK-hiPSC-aCMs 的 APD10、APD50、APD90 均有所恢復(fù)。與 DIO 小鼠一樣，經(jīng) PA 處理的 hiPSC-aCMs 也顯示出 I_Ks 和總 I_K 的增加，而在 PA-GSK-hiPSC-aCMs 中則被逆轉(zhuǎn)。全細(xì)胞膜片鉗檢測結(jié)果顯示，慢性 PA 治療縮短了 APD 在20%、50% 和 90% 的復(fù)極化，而 OA 治療顯著延長了 APD50，增加了除極速度。與牛血清白蛋白（BSA）-hiPSC-aCMs 相比，PA-hiPSC-aCMs 的 AP 最大上升速度和最大（APAmax）振幅顯著降低。此外，與對照組 hiPSC-aCMs 相比，PA-hiPSC-aCMs 也顯示出 I_Na 和 I_Ca,L 密度的降低，而在 PA-GSK-hiPSC-aCMs 中則發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。因此，這提示在 DIO Nox2-KO 小鼠和 PA-GSK-hiPSC-aCMs 中，NOX2 的基因缺失和藥理抑制消除了肥胖介導(dǎo)的心房 APD 縮短，并緩解了肥胖誘導(dǎo)的房顫。超聲心動圖分析顯示，與對照組小鼠相比，DIO 小鼠的 LA 和 RA 均增大。其他超聲心動圖參數(shù)，如左心室射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、主動和被動心室充盈之間的脈搏波比 （A'/E'）、心輸出量和左心室后壁直徑在 4 組小鼠中保持不變。

圖4. 使用 NOX2 小分子抑制劑 GSK-2795039 對 PA 處理的 hiPSC-aCMs 進(jìn)行抑制 NOX2 時，可以逆轉(zhuǎn)肥胖誘導(dǎo)的離子通道重構(gòu)

8. 抑制 Nox2 表達(dá)降低了 DIO 小鼠和 PA-hiPSC-aCMs 中 ROS 的產(chǎn)生
使用 H2DCFDA 染色（一種成熟的可視化和定量胞質(zhì) ROS 的技術(shù)），評估了對照組小鼠、DIO 小鼠、Nox2-KO 小鼠、DIO Nox2-KO 心房心肌細(xì)胞和 BSA-、PA-、PA-GSK-hiPSC-aCMs 的 ROS 水平（在基線和染色 12 分鐘后進(jìn)行測量）。與對照組、Nox2-KO 和 DIO Nox2-KO 小鼠心房肌細(xì)胞不同，DIO 小鼠的 ROS 水平顯著升高。這種增長持續(xù)了 12 分鐘，這是 DIO 組獨有的趨勢。同樣，與 BSA- 和 PA-GSK-hiPSC-aCMs 相比，PA 處理的 hiPSC-aCMs 從一開始就出現(xiàn)升高現(xiàn)象，并且在 12 分鐘內(nèi)持續(xù)顯著升高。

圖6. 使用 NOX2 小分子抑制劑 GSK-2795039 對 PA 處理的 hiPSC-aCMs 的 NOX2 抑制逆轉(zhuǎn)了肥胖誘導(dǎo)的離子通道重構(gòu)

研究結(jié)論：
本研究強調(diào)了 NOX2 誘導(dǎo)生成的 ROS 和 PITX2 在肥胖介導(dǎo)的房顫中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。機制研究表明，在肥胖小鼠、PA  處理的 hiPSC-aCMs 中以及敲除 NOX2 后，使用 NOX 阻滯劑和 NOX2 特異性抑制劑靶向心房氧化損傷和 ROS 產(chǎn)生，不僅可以預(yù)防和治療 AF，還可以延緩肥胖個體中 AF 的進(jìn)展。本課題研究結(jié)果對房顫肥胖患者的靶向治療具有重要意義，靶向抑制 NOX2 可能是一種新的治療肥胖患者的方法，并為肥胖介導(dǎo)的房顫患者提供新的輔助治療方案。