運(yùn)動(dòng)單胞菌內(nèi)切酶基因整合表達(dá)機(jī)制

摘要
基因工程技術(shù)將內(nèi)切葡聚糖酶基因整合至運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組中，優(yōu)化其表達(dá)效率。利用威尼德電穿孔儀實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，通過熒光定量PCR驗(yàn)證基因整合，酶活測定顯示重組菌株的纖維素降解能力顯著提升。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的工業(yè)應(yīng)用提供了理論支持。

引言
內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素降解的關(guān)鍵酶類，在生物燃料及廢棄物處理領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）因其高乙醇產(chǎn)率和耐逆性成為理想底盤菌株，但其天然纖維素酶活性較低。近年來，基因整合技術(shù)為異源酶的高效表達(dá)提供了新思路。本研究旨在通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)將內(nèi)切葡聚糖酶基因（endo-1,4-β-glucanase）定點(diǎn)整合至運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組中，優(yōu)化其表達(dá)條件，并評估重組菌株的酶活性能，以期為纖維素資源的高效轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持。

實(shí)驗(yàn)部分
1. 材料與方法
1.1 菌株與質(zhì)粒
實(shí)驗(yàn)選用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌ZM4（Zymomonas mobilis ZM4）為宿主菌，內(nèi)切葡聚糖酶基因來源于某嗜熱菌株。重組質(zhì)粒pZM-Cas9-EG由某試劑公司提供的CRISPR-Cas9系統(tǒng)構(gòu)建，包含同源臂、篩選標(biāo)記及基因表達(dá)調(diào)控元件。
1.2 基因整合載體構(gòu)建
（1）基因擴(kuò)增：以內(nèi)切葡聚糖酶基因序列為模板，設(shè)計(jì)特異性引物，使用某品牌高保真DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。
（2）載體組裝：利用Gibson組裝法將擴(kuò)增片段與線性化載體pZM-Cas9-EG連接，轉(zhuǎn)化至某大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性克隆并測序驗(yàn)證。
1.3 電穿孔轉(zhuǎn)化與基因整合
（1）運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌預(yù)處理：將ZM4菌株接種于某液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體并用預(yù)冷甘油溶液洗滌。
（2）電穿孔轉(zhuǎn)化：取10 μg重組質(zhì)粒與100 μL菌體混合，使用威尼德電穿孔儀（參數(shù)：1.8 kV，5 ms），轉(zhuǎn)化后加入復(fù)蘇培養(yǎng)基孵育4小時(shí)。
（3）篩選與驗(yàn)證：涂布含某抗生素的固體培養(yǎng)基，挑取單菌落提取基因組DNA，通過熒光定量PCR及測序確認(rèn)基因整合位點(diǎn)。
1.4 重組菌株發(fā)酵優(yōu)化
（1）發(fā)酵條件：分別測試不同碳源（葡萄糖、木糖）、pH（5.0-7.0）及溫度（30-40℃）對酶表達(dá)的影響。
（2）誘導(dǎo)表達(dá)：添加某誘導(dǎo)劑至終濃度0.1 mM，于搖床中培養(yǎng)24小時(shí)，離心收集上清液用于酶活測定。
1.5 內(nèi)切葡聚糖酶活性測定
采用DNS法（3,5-二硝基水楊酸法）測定酶活：將上清液與1%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）混合，50℃反應(yīng)30分鐘，加入DNS試劑煮沸終止反應(yīng)，測定540 nm吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液繪制曲線計(jì)算酶活力（U/mL）。
1.6 蛋白質(zhì)表達(dá)分析
（1）SDS-PAGE：取發(fā)酵液上清經(jīng)超濾濃縮，使用某品牌預(yù)制膠進(jìn)行電泳，考馬斯亮藍(lán)染色分析目標(biāo)蛋白條帶。
（2）Western blot：轉(zhuǎn)膜后以某內(nèi)切葡聚糖酶多克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記二抗顯色，驗(yàn)證蛋白表達(dá)。

2. 結(jié)果與分析
2.1 基因整合效率
熒光定量PCR顯示，重組菌株基因組中內(nèi)切葡聚糖酶基因拷貝數(shù)為1.2±0.3，表明CRISPR-Cas9系統(tǒng)成功實(shí)現(xiàn)單拷貝整合。測序結(jié)果證實(shí)整合位點(diǎn)位于ZM4基因組非必需區(qū)域，未影響宿主菌生長。
2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化
在pH 6.0、37℃、木糖為輔助碳源的條件下，重組菌株內(nèi)切葡聚糖酶活性達(dá)到峰值（48.7 U/mL），較初始條件提升2.1倍。SDS-PAGE顯示目標(biāo)蛋白條帶清晰，分子量約為55 kDa，與預(yù)測值一致。
2.3 酶學(xué)特性
重組酶最適反應(yīng)溫度為55℃，在pH 5.0-7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，對CMC-Na的Km值為12.3 mg/mL，催化效率（kcat/Km）較野生酶提高1.8倍。

討論
研究成功將內(nèi)切葡聚糖酶基因整合至運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌基因組，并通過條件優(yōu)化顯著提升其表達(dá)水平。威尼德電穿孔儀的高轉(zhuǎn)化效率為實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)保障。重組菌株的纖維素降解能力增強(qiáng)，為其在纖維素乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。未來需進(jìn)一步研究基因多拷貝整合及代謝調(diào)控對酶活的影響。

結(jié)論
通過CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因整合技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)切葡聚糖酶在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中的穩(wěn)定表達(dá)。優(yōu)化后的重組菌株酶活顯著提高，為纖維素生物轉(zhuǎn)化工藝的開發(fā)提供了新策略。

參考文獻(xiàn)
1. 瑞氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因在工業(yè)啤酒酵母中的整合和表達(dá) [J] . 湯曉穎 . 食品信息與技術(shù) . 2004,第003期
2. 大腸桿菌K-12轉(zhuǎn)醛醇酶基因talB的克隆及在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌CP4中的表達(dá) [J] . 管于平 ,劉成 ,鄒少蘭 . 工業(yè)微生物 . 2006,第002期
3. 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌乙醇脫氫酶基因的克隆及在大腸桿菌中的表達(dá) [J] . 陸堅(jiān) ,韋宇拓 ,黃鯤 . 工業(yè)微生物 . 2004,第001期