藥物分析新技術和進展

藥物分析是藥學中的一門分支學科,它是藥學和分析科學的交叉學科,其內容包括藥物(原料,制劑,制藥原料及中間體等)的檢驗,藥物穩(wěn)定性,生物利用皮,藥物臨床監(jiān)測以及中草藥(動物,植物,礦物類)檢定等諸多方面的有關定性定量分析工作.其目的是確保藥物的質量,保證病人用藥的安全有效.此外,像毒物分析,運動員的興奮劑檢測,成瘤藥物檢查等也屬于藥物分析的范疇.藥物分析使用化學,物理,生物,數學,計算機及自動化等許多學科的手段,并隨著這些學科的發(fā)展而發(fā)展.在這些學科中,與藥物分析關系最密切的還是化學,尤其是分析化學的手段在藥物的研究與開發(fā)中應用得最為廣泛.本章將就分析化學在藥物研究與開發(fā)中的應用及藥物分析的前景進行討論。

一,藥典與分析方法

為保證藥品的質量,很多國家都有自己的國家藥妙"2J,它是記載藥品標推和規(guī)格的國家法典.是國家管理藥品生產,供應,使用與檢驗的依據,通常都由專門的藥典委員會組織編寫,由政府頒布施行.凡屆藥典收載的藥品,其質量在出廠前均需經過檢驗,并符合藥典規(guī)定的標準和要求,否則不得出廣,銷售和使用.藥典中列出許多分析方法,分別用于不同藥物的檢驗.從這些方法可以看出該國的藥物分析水平,但是有一個規(guī)定,就是所提出的方法必須是很成熟的方法,同時也是容易推廣和掌握的方法.因此盡管可能已經報道有很先進的或者用很新技術或儀器的方法,在沒有經過更多的考驗。

之前,還是不能收載在藥典中.換句話說,就是藥典中給出的方法并不是越新,越高級越好.這一點,分析工作者有時不夠理解,常以為方法越新越好.還有一點需要指出的是,藥典中所規(guī)定的指標都是該藥物應達到的最低標準,各生產廠可制定出自己的高于這些指標的標推,以生產出更高質量的藥物.此外,藥廠也完全可以便用自己認為合適的分析方法進行藥品的質量控制,但是如果一旦產品質量出現(xiàn)問題,需要進行仲裁時,則要以藥典收載的方法為準。

藥典中對每一個藥品及其制劑都單獨列為一個項目內容:

(1)性狀

記載該藥品的各種物理化學性質.一般包括外觀,.

(2)鑒別

色澤,溶解度,晶型,熔點,比重,疥光率,紫外吸收系數等.這些都是藥品的特性,是否為該檢品

根據這些性質可以幫助初步判斷

龜或產物,有時可結合紫外吸收與紅外光譜,幫助鑒別撿品是否與品名相符.

(3)槍查

系指雜質的檢查.需要檢查的雜質項目,主要是根據生產該藥品所用的原料.制備方法,貯存容器與貯存過程可能發(fā)生的變化等情況.考慮可能存在的雜質,再聯(lián)系這些雜質的毒性,經綜合考慮而提出的.一般情況下,對雜質規(guī)定有一定限量,不能超過這個限量,否則即不合格。

(4)含量測定

主要確定藥品中有效成分的含量范圍,測定方法力求簡便快速,易于推廣和拿握.

同時還要考慮所用儀器是否容易獲得與使用情況 我國藥典收載的常用方法也在隨著學科的發(fā)展而不斷有所增加與改進N.如1953年版只有重量法,容量法(蘸堿滴定法,氧化還原法,銀量法),旋光法,比色及紫外線吸收系數測定法,1963年版就增加了絡合滴定法.非水溶液滴定法.費休式水分測定法,分光光度法,極譜分析法(1977年版取消),其后出版的1977,1985,1990,1995年版的藥典又陸續(xù)增加了亞硝酸鈉重氮化滴定法.電位及水停灑定法.氧瓶燃燒法.原于吸收法,熒光分析法.紅外光譜沈,

色譜法(柱色譜,紙色譜,薄層色譜,薄層掃描法,氣相色譜,高效液相色譜),電泳法(紙電泳,凝放電泳,酯蘸纖維素膜電泳)等方法,與國際上其它藥典所用的方法大致相同。

二,藥物分析方法

前面已經提到一些藥物分析中常用的方法,藥典中使用的方法目前多趨向于色譜法,尤以高效液相色譜為普遍.當然,分析化學中常用的分析方法仍都有應用,如基于化學反應的重量法和各種容量法;基于光學或譜學的紫外(UV),可見(Vis).紅外(IR),熒光(凡),拉曼[R刪),核磁共振(NhQ),各種計算分光光度法等;基于電化學的各種極譜法,伏安法,庫侖法,離子選擇電極及各種傳感器.利用電流和電位的各種滴定方法等;各種色譜方法,除上述的紙色譜(PC),薄層色譜(TLC),氣相色譜(GC),高效被相色譜(HPLC)外,離子色譜(Ic),排阻色譜(sEc),超臨界流體色譜(SFC)也都在發(fā)揮作用,新興的毛細管電泳(哪)和電色譜法(EC)正在引起分析工作者的極大興趣,在國內外都是熱門課題,發(fā)表的文章每年都在增加.估計不久的將來.隨著儀器的普及,毛細管電泳法將會被藥典所收載.質譜的發(fā)展也很迅速,除單獨使用外,與各種色譜儀的聯(lián)用也受到重視,氣相色譜—質譜聯(lián)用(Gc小賜)已很普遍,液相色譜—質諾聯(lián)用(比刷S)由子幾種新接口的出現(xiàn)也已趨成熟,商品儀器己較普遍,國外有關液相色譜—質譜聯(lián)用的工作已有很多,甚至液相色譜—質譜—質譜聯(lián)用(LC朋S刷s)也被不少藥物研究和生產單位較廣泛地用于藥物代謝的研究 在國內,則由于儀器需要進口,且價格昂貴,工作還很少開展,有待今后加強努力.超臨界流體色譜和毛細管電泳與質譜的聯(lián)用也已有不少報道 化學計量學在分析中的應用國內己做了不少工作,尤其在分光光度法方面已有不少報道.在解決色譜重疊峰,選擇色譜流動相及其它方面的工作也在進行。

三,藥物代謝研究中的分析工作

藥物的代謝轉化是指藥物進人人體后,在體內進行一些反應,發(fā)生結構變化,使脂溶性的藥物獲得極性基團,增加水溶性,而利于從腎及膽道排泄的過程〔d.藥物在體內的整個過程通常用四個英文字母表示,即A1)h吸.A表示吸收(ab印rption),為藥物被生物體的吸收;D為分布(dt姚nbutlon),為藥物在生物體內的分布;M為代謝(限tab01i刪),即藥物在體內的代謝轉化;E為排泄(exc肥tlon),即藥物及其代謝產物自體內的排除 藥物的代謝轉化一旅分為兩類反應:第一相反應包括氧化,還原,水解,水合,脫硫乙酰化,異構化等;第二相反應為結合反應,主要包括葡萄糖醛酸化,硫酸酯化,谷骯甘肋結合,乙�；�,甲基化,氨基酸結合,脂肪酸結合,以及縮合等.

藥物的兩相轉化反應均需要體內多種酶的參與.經過一相反應后,藥物分子上形成羧基,經基,醇基,胺基等,便于進行第二相結合反應,形成極性更高,水溶性更大的代謝產物,有利于從腎及膽道排出體外.藥物經過機體的轉化,可能發(fā)生相應理化性質的改變,從而改變其藥理和毒理活性,如代謝失活,代謝活化,藥理活性增強或減弱,以及形成毒物及致癌物等.因此研究藥物的代謝轉化過程,明確藥物的代謝轉化途徑,有助于理解藥物的藥理作用及毒副反應的機理,指導臨床合理用藥。

藥物代謝轉化的研究一般有兩種途徑.一種途徑為通過薄層色譜,高效液相色譜等手段從體內體外代謝樣品中分離,檢測,制備代謝物純品,然后利用紫外,紅外,核磁共振,質譜等手段進行結構鑒定;另一途徑是以質譜為結構鑒定基礎的色譜—質譜聯(lián)用方法,井輔以同位京標記,衍生化反應以及純品對照等手段,對代謝產物進行結構鑒定.后者尤其適合于生物體液中藥物及其代謝產物的定性,定量測定與藥物代謝動力學方面的研究。

1.以TLC,HPLC等分離制各為基礎的分析方法

這一類方法主要包括代謝物的分離,檢測,純品制備與結構鑒定幾方面的工作.藥物的分離檢測,主要方法有柱色譜,TLL,Gc與叩凹 叩比常用于藥物及其代謝產物的同時分離與檢測.根據藥物代謝的一般規(guī)律,代謝物的極性較原藥大,所以在反相叩比系統(tǒng)中代謝物一般先于原藥被洗脫出來,特別有利于代謝產物的識別.與BP—叩陽臺的檢測方法主要有電化學方法(EC),熒光檢測(四),紫外吸收檢測

(W)與放射性檢測(肌).二極管陣列檢測器(則)由于能同時進行多波長檢測,并問步記錄色譜峰的吸收光譜,檢測峰純度,與叩U配合,已成為快速分離檢測未知代謝產物的有力工具,適合于體外代謝研究的代謝條件的優(yōu)化,以及體液中未知代謝產物的分離檢測柱色譜,TIj,制各HN—L由于樣品容量大,操作條件靈活,適合于代謝產物的制備與純化 對體外,體內代謝進行色譜分離前,需要對樣品先進行提取分離,必要時先做去蛋白處理.常用的提取方法合液液提取與灑固提取.液液提取中常用的溶劑有乙酸乙酯,::氯甲烷,氯仿,乙醚等.根據藥物及其可能形成的代謝產物的性質,可能需要調節(jié)溶液的PH值,或加入離子對試劑等.以盡可能全囚地提取出主要代謝產物.液固提取由于需要的溶劑量相對較少,提取時沒有乳化現(xiàn)象,提取的代謝物極性范圍較廣等優(yōu)點,而R益受到重視.常用的因相提取材料合5ep—PaLCl8柱,XAI)2,比nd E1叭校等 而M(;K(3rniHg爭"介紹的鹽—溶劑對提取法,適合廠多種生物體灑中弱酸件,中性,堿性代謝物的提取,并且問收率高.

分離制備得到的代謝物純品的結構鑒定主要借助于紫外,紅外,核磁共振,質譜等手段.由于代謝物的結構與原藥密切相關,因此比較它們波語信息的異同,可以推斷代謝產物的化學結構.質譜中各種軟電離技術.如場解吸(凹),快原子轟擊(F朋)等的使用,有利于提供代謝產物的分子量信息.氫NMR譜,碳NMR諾以及其它有關的NMR譜,如NoE等效術在藥物代謝產物研究小已有廣泛的應mL"'81,能夠提化有關代謝產物分子結構較為詳盡的信息,能夠用于區(qū)別體置異構體及立體異構體。

2.色譜—質譜聯(lián)用分析方法

色譜—質諾聯(lián)用方法由于將色譜的高度分離能人與質譜的高檢測靈敏度,定性專屬性集于一身,已在藥物代謝的分離與鑒定工作中得到廣泛應用.這類方法的主要依據是藥物發(fā)生代謝轉化后,一般僅是在原藥的基礎上進行部分結構修飾,藥物的母體結構一般不會發(fā)生太大變化,因此代謝產物與原藥常有相似的質譜特征離子,據此可以對代謝產物進行識別,再結合共它釁片特征,對共結構作出合理的判斷.實際應用中,常結合同位素標記來輔助代謝物的識別,并將代謝物的EI肥行為與合成品對照,進一步證實其化學結構 色譜—質諾聯(lián)用方法由于靈敏度高,特異性強,特別適用于體掖中疽量代謝物的檢出及質譜行為較相似的系列化合物代謝轉化規(guī)律的研究工作氣相色譜—質譜聯(lián)用技術(GC刷s)由于商品化儀器出現(xiàn)較早,在藥物代謝研究中應用較為廣"泛.但氣相色譜對樣品的極性與熱穩(wěn)定性有一定要求,因此在用GC朋S分析前,樣品的預處理頗為重要,藥物及其一相,二相代謝產物的熱穩(wěn)定性,揮發(fā)性,極性可能差異較大,需要根據具體情況對樣品先進行水解處理或衍生化處理 其中硅醚化衍生方法在藥物代謝研究中應用最為普遍,有多種硅醚化試劑可供選擇,常用的有踢T12A/1%IM暢,脅等.衍生化后的代謝物不但色譜行為改善,而且其質譜行為對代謝物的結構闡明能提供更多證據近年來.各種液相色譜—質譜(比爪仍)接口的研制成功及商品化,使比爪億成為藥物代謝及藥物代謝動力學研究的有力工具 與CC肥技術相比,比朋S的樣品前處理簡單,一般不需要水解或衍生化處理,可直接用于藥物及其一相,二相代謝產物的同時分離與鑒定較早的比爪侶接口有傳送帶(陽),粒子柬(陽),熱噴霧(蠅),其中咒化肥較為成熟,靈敏度較高,在藥物代謝研究中應用已較夕卜u].新近出現(xiàn)的大氣壓電高技術.電噴霧(ES)和大氣壓化學電離(A1吧I)技術,是液相色譜—質譜聯(lián)用接口方面的一大進步,國外已有商品供應,正在受到藥物研究工作者的重視與歡迎,府用日益廣汐'卜14J 電噴霧技術作為一種相對"軟"的電離技術,特別適合于藥物第二相結合物,如葡萄糖醛酸結合物,硫酸酯結合物等的檢出.大流量電噴霧技術(me8dHow—ES)與大氣壓化學電離技術還能與內徑2.1刪或4.6刪的常規(guī)HPLL校直接聯(lián)用 同時在AKl6術中,通過靈活改變錐電壓(咖c W1噸e),可以獲得與MS肋S中碰撞誘導解離(cH))相比擬的分子誘導碰撞淬片信息,克服丁一般化學電高技術碎片信息少的缺點UZ/Ms肋s,MS/kIb聯(lián)用技術中恒定中性丟失(4L)與CID技術使藥物代謝產物的分離,檢測與結構簽定的過程變得更為方便和快捷.總之,隨著質譜技術以及液質接口技術的不斷發(fā)展,液相色譜—質譜聯(lián)用終將成為研究藥物代謝及藥物代謝動力學十分有利的分析手段。

四,手性藥物的分離分析方法

手性是自然界普遍存在的特征 電物體系統(tǒng)內部的受體,酶,核酸,蛋白以及多糖等都具有與其功能相適應的手性結構 藥物存在對映體時,在其進入生物體內后,因受這些手性物質的選擇性控制,其代謝途徑和藥理作用常不相同,生物活性和藥效也就不同,而其毒副作用也常存在差異.近年來的臨床實踐多次證明了這一點.即其中一種異構體有治療作用,而另一對映體則無作用,或甚至有很強的毒性或副作用 據認為現(xiàn)在市場上銷售與臨床上使用的許多化學合成藥物有75%以1:是外消旋體的形式.即為兩種光學異構體的等量混合階"i 為了用藥的安全有效,有必要對手性化合物的各個異構體分別進行考察,了解各自的生理活性.不少國家己規(guī)定,要求申報手性藥物時,必須對不同異構體的生理作用敘述清楚.因此手性藥物的分離和測定在藥物分析中就占有很重要的地位,以便對藥物進行質量控制,并為藥物的藥理,毒理研究提供分析手段.由于對映體的物理化學性質幾乎完全相同,經典的分析方法和一般的色譜方法無能為力 近年來手性分離已成為分析化學中的一個熱門課題,也取得了很大的進展.目前最常用的方法是色譜法和毛細管電泳法.分離時可采取兩種途徑,即直接法和間接法.兩種方法都涉及非對映異構體的形成,所不同的是所形成的非對映異構體是否具有可逆性.采用間接法時,將對映體混合物與光學純的手性試劑反應,生成兩個非對映異構體,然后用常規(guī)的色譜方法分離 這種方法分離的是衍生產物而不是原對映體.間接法的優(yōu)點是:(1)可使用價格便宜,柱效較高的非手性柱(如咖);(2)可選用具有各種發(fā)色團或較強熒光發(fā)射基團的手性試劑.但其不足之處是:(1)對映體必須含有能與手性試劑反應的基團;[2)衍生化反應操作復雜,費時.且容易造成組分的損失;(3)對手性試劑的純度,儲存和反應過程中的穩(wěn)定性要求較高;(4)兩個對映體的衍生化反應速率應當一致;(5)生成的非對映體應當容易分解為原來的對映體.

在直接法中,又分為采用手性固定相和手性流動相添加劑兩種操作.手性固定相法是基于樣品與鍵合到載體表而的于性選擇刑(又稱于性識別劑)間形成暫時的非對映絡合物的能量差或穩(wěn)定性不同而達到手性分離.手性流動相添加刑法則是通過對映體與添加到流動相中的手性物質分子形成—對非對映的絡合物,由于非對映絡合物的穩(wěn)定性,

在流動相中溶劑化作用或絡合物與固定相的鍵合等性質的差異而得到分離,與間接法相比,直接法具有很大優(yōu)勢.為氣相色譜法,高效液相色語法及超臨界流體色語法設計使用的手性固定相己有多種成為商品出售,其應用日益廣aL'HN,新的手性固定相和手性選擇劑仍不斷出現(xiàn).但手性固定相的價格較高,在一定程度上限制T它的使用.

值得一提的是近來利用毛細管電泳拆分手性化合物的工作日見增歲"ih,尤其是使用環(huán)糊精及其衍生物為手性選擇劉的報道占主要部分.其它如冠醚,低聚糖,蛋白質,大分子抗生素等也有手性拆分的能力.這方面的研究正方興來艾.但毛細管電泳的樣品處理量太小,無法用于制備工作。

五,展望

上面簡單地討論了分析化學在藥物的質量控制,新藥研究,藥物代謝,手性藥物分析等力面的應用,從中可以看出藥物分析所起的作用 前面也已經提到,藥物分析涉及的面很廣,其對象更為多種多樣,包括合成藥物,生物藥品,中草藥,毒物,成癮藥物,興奮劑,臨床藥物監(jiān)測,等等.隨著生物工程的發(fā)展,基因藥物會日益增加,肯定會時藥物分析方法和質量控制內容提出更多更高的要求,可能會引入更多的新的儀器分析方法,以及生物技術和生化方法.藥物分析中所使用的方法現(xiàn)在已是多種多樣,隨著其它學科的發(fā)展,老的方法將不斷更新,新的方法將層出不窮.此外,計算機的發(fā)展更是迅速,它在分析中的應用必將不斷深入,從而帶動著分析儀器也將縮短更新?lián)Q代的時間,并將出現(xiàn)多種智能化,微型化的自動分析儀器.藥物分析工作者也必須努力學4新的有關知識,才能跟上科學的發(fā)展與進步,做好自己的工作。